奶牛溶菌酶在大肠杆菌中的分泌表达及抑菌活性研究

为了能在体外获得奶牛溶菌酶(LYZ)并研究其抑菌活性,试验采用人工设计并合成LYZ基因CDS序列,将其克隆至表达载体p ET32T并转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性菌株,经IPTG诱导,初步纯化表达产物,并对其进行SDS-PAGE分析和抑菌性检测。重组质粒经PCR、双酶切鉴定结果正确,表达产物经SDS-PAGE检测,分子量约为33 k D,与目标蛋白质一致,且对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑菌作用。本研究成功构建原核表达载体LYZp ET32T并获得了有抑菌活性的奶牛溶菌酶蛋白。     

奶牛溶菌酶基因原核表达载体的构建

为了构建奶牛溶菌酶(lysozyme,LYZ)原核表达载体,试验人工设计并合成LYZ基因CDS序列,将其克隆至表达载体p ET32T,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定。结果表明:PCR扩增和双酶切产物的分子质量分别为1 000 bp和400 bp,与预期大小一致;扩增产物经测序鉴定,也与目的片段完全一致。说明原核表达载体LYZp ET32T构建成功。     

牛乳溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析

为真核表达牛乳溶菌酶,本研究在通过酵母偏爱密码子改造并人工合成LYZ1基因的基础上,将LYZ1基因经克隆构建了高效表达具有生物活性牛乳溶菌酶的分泌型表达载体pPICZα-A-LYZ1,将其经SacⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母菌株GS115中,通过Zeocin筛选和PCR鉴定后的阳性重组菌用甲醇诱导60h后,进行SDS-PAGE和western blot鉴定,用溶壁微球菌对其进行活性检测,并对其进行体外抑菌效果检测分析。结果表明:分泌表达的重组目的蛋白约16ku,而且抗血清具有良好的反应原性。活性检测表明,培养液中重组溶菌酶活性达到2842u/mL。体外抑菌试验结果表明,重组牛乳溶菌酶对标准葡萄球菌及大肠杆菌菌株具有较好的抗菌作用,而对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌作用较弱。     

鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

研究从鸡输卵管组织提取细胞总RNA,根据Gene Bank中已发表的鸡溶菌酶基因序列,设计合成特异引物,合成cDNA序列,并以此为模版,PCR扩增鸡溶菌酶基因。用Xho I和Xba I对LYZ基因的PCR产物和真核表达载体pPIC6αA进行双酶切后转化到大肠杆菌(DH5α)中,构建成为真核重组表达载体pPIC6αA-LYZ。该载体经PstXI酶切线性化后,以电击转化方法导入到毕赤酵母宿主菌X-33中,经Blasticidin抗性筛选,得到鸡溶菌酶基因重组毕赤酵母菌株;甲醇96h(发酵罐诱导100h)诱导表达,经Wetern-blot检测分析,基因重组工程菌株摇瓶诱导表达溶菌酶的表达量约为4mg/l,发酵罐诱导表达的表达量约为10mg/l。     

牦牛胃溶菌酶在解脂耶氏酵母中的重组表达及性质研究

研究牦牛胃溶菌酶基因(yak stomach lysozyme gene, ys LYZ)在解脂耶氏酵母中的异源表达、分离纯化及抗菌机制。通过人工合成构建p INA1297-ys LYZ,转化至宿主解脂耶氏酵母(Polh)菌株,分别培养24、48、72 h及96 h。发酵上清液经纯化后得到重组牦牛胃溶菌酶(recombinant yakstomach lysozyme, rys LYZ)。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)检测rys LYZ的分子量,用检测试剂盒测定其比活,通过电镜观测其对金黄色葡萄球菌的作用,并对rys LYZ在模拟猪胃液中的降解情况进行了观察。结果表明:rys LYZ的分子量为15 k Da,其表达量在培养72 h时最高,纯化后比活为1 855.42 U/mg。电镜下观察到rys LYZ作用金黄色葡萄球菌后,菌体出现孔洞,最终崩解。在模拟猪胃液中,rys LYZ可在胃蛋白酶作用4 h后仍保持部分完整,表明其具有优良的抗胃蛋白酶能力。本研究得到的rys LYZ能够在酸性环境中保持高酶活,主要通过破坏细菌胞壁发挥抑菌作用,并能有效抵抗胃蛋白酶的降解。     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。     

乳房链球菌GAPC基因的克隆及原核表达

为了重组表达乳房链球菌表面脱氢酶GAPC基因,为免疫学研究提供目标蛋白,用PCR方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出GAPC基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a（＋）-GAPC。用BL21（DE3）/pET系统表达Trix-GAPC融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果表明,PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中乳房链球菌（AF421900.1）GAPC的基因序列同源性为99%。SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21（DE3）/pET-32a（＋）-GAP总蛋白中出现一条分子质量为55ku的新蛋白带。Western blot分析显示,GAPC蛋白可与乳房链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。该研究已成功表达了GAPC,为GAPC在细菌致病中作用的研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

驴乳溶菌酶原核表达及活性检测

为探究驴乳源溶菌酶特性,本研究人工合成了驴乳溶菌酶基因DKLYSC1,并连入原核表达载体pET32a(+)中经诱导、表达,通过SDS-PAGE、western blot及比浊法检测重组溶菌酶表达及活性。结果显示,重组溶菌酶主要以包涵体形式高效表达,分子质量约31 ku;纯化的重组蛋白可以与抗His标签抗体特异性结合,特异性较强;比浊法测定复性蛋白比酶活为124.74 U/mg。本研究在大肠杆菌中表达了驴乳溶菌酶,并获得具有活性的复性蛋白,为驴乳溶菌酶的基础研究和应用奠定了基础。     

奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。     

貂源绿脓杆菌流行株toxA基因克隆序列分析及原核表达

为了研究貂源绿脓杆菌流行株toxA基因的遗传变异情况,并将toxA基因进行原核表达,本试验以貂源绿脓杆菌DNA为模板,经PCR扩增表达外毒素A蛋白的toxA基因,约1 917 bp的片段,将产物克隆与pMD-18T载体并测序。结果表明,12株流行株的序列与GenBank中的标准产毒株PA103株和PA01株的遗传关系较近,显示外毒素A毒性的氨基酸均未发生突变,流行株变异不大。将该基因亚克隆到原核表达载体pET32a,转化BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度的IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE与Western Blot鉴定,结果表明,可产生相对分子量约为78 kDa的表达产物,成功地构建了外毒素A蛋白的重组表达系统。     

鸡传染性贫血病毒VP2基因的克隆和原核表达

从组织病料中提取到的鸡贫血病毒核酸经PCR扩增得到vp2基因,并将其克隆到表达载体pET32a上,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果VP2基因在大肠杆菌中成功表达。以表达产物免疫小鼠4次,制备了抗CAVVP2的多克隆抗体。通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验(IFA),结果为阳性。这表明表达产物保留了CAV相关的抗原性。为进一步研究CIA临床诊断奠定了基础。     

人溶菌酶基因在奶牛乳腺中的表达试验

为了提高牛奶品质，降低牛奶细菌含量，使其性质更接近于人奶。将表达人溶菌酶基因的动物乳腺特异表达载体注射到奶牛的乳区，然后根据基因注射前、后奶样的C．M．T．试验结果和溶菌酶的表达量判定效果。试验结果表明，重组质粒在奶牛乳腺中能表达有活性的人溶菌酶，表达量达1．96μg／ml。能使奶样的C．M．T．试验转阴。     

猪α干扰素基因在pET32a表达载体中的表达和鉴定

利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础.     

奶牛黏附分子MadCam-1基因的克隆及原核表达

原核表达MadCam-1基因、纯化MadCam-1黏附蛋白,并制备其多克隆抗体,为进一步功能研究奠定基础。根据MadCam-1的已知基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术扩增MadCam-1基因片段插入到原核表达载体 pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒 pGEX-4T-1-MadCam-1,转化入E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,以纯化后的融合蛋白为抗原,免疫家兔,获得抗血清。结果表明,重组表达质粒pGEX-4T-1-MadCam-1经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%。表达产物经Western blotting鉴定,结果证实成功表达了分子质量约为50 ku 的蛋白质。纯化的蛋白质免疫家兔后,经ELISA检测多克隆抗体效价为1∶32000。因此,成功获得了奶牛 MadCam-1多克隆抗体,为进一步研究奶牛黏附分子 MadCam-1的功能奠定了基础。     

新孢子虫SRS2基因的克隆及原核表达

为构建表达新孢子虫重组蛋白SRS2原核表达系统,本研究以新孢子虫基因组为模板PCR扩增SRS2蛋白部分基因,获得大小约为998bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌PET-32a载体中,IPTG诱导重组大肠杆菌,通过SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS-PAGE分析,表达的重组SRS2蛋白分子量约为54kD,免疫印迹结果表明,表达的重组蛋白与牛抗新孢子虫阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究诊断和治疗新孢子虫病奠定了基础。     

奶牛骨钙素基因的克隆与原核表达

以奶牛骨组织提取的RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增出奶牛骨钙素全长cDNA，然后将扩增产物重组到PMD-18T载体中，测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨钙素全长cDNA为303bp，编码100个氨基酸，与GenBank中的X53699的序列完全相同。通过加端PCR技术连接单链DNA片段人工定点同义突变，将奶牛骨钙素成熟蛋白基因中的大肠杆菌稀有密码子同义突变为大肠杆菌常用密码子并亚克隆至PET-32a表达载体．转化到宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，成功表达出奶牛骨钙素融合蛋白。     

猪瘟病毒NS23'端基因的克隆与原核表达

从真核表达载体pEGFP-NS2中克隆得到猪瘟病毒(CSFV)NS2 3'端的基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,克隆了大小为363 bp NS2 3'端的基因,重组载体pET-NS2-C363在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Weste...     

副猪嗜血杆菌黏附基因的表达和免疫原性鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)黏附素基因的表达产物并对其进行免疫原性鉴定,本研究采用PCR技术扩增了HPS黏附素基因序列,将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接,得到表达重组质粒。通过EcoRⅤ和HindⅢ双酶切鉴定和测序确认正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析,获得了59.5ku的表达产物,与预期大小的黏附素蛋白分子量一致。经western blot检测,表达产物与HPS阳性血清反应,证明表达产物具有一定的免疫活性。提示本研究所表达的蛋白将有助于HPS的血清学诊断和疫苗的研发。     

弓形虫CDPK1-EF基因的克隆与原核表达

CDPK是一类钙依赖蛋白激酶,其可参与调控寄生虫入侵,外出宿主细胞,配子的形成及在宿主体内移行等。采用RT-PCR技术,扩增弓形虫RH株目的基因钙依赖蛋白激酶EF模体(CDPK1-EF),然后将其克隆至表达载体pET-32a,以构建重组质粒ET-32a-CDPK1-EF,经IPTG诱导目的蛋白表达,并采用Ni-NTA亲和层析法纯化,最后经SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果,成功地克隆出弓形虫CDPK1-EF基因,序列比对表明,其与GenBank报道的相关序列同源性达100%。采用SDS-PAGE技术对诱导表达蛋白以及纯化产物检测发现37 ku目的蛋白出现,与预期结果相一致。本文在国内首次成功克隆和表达弓形虫RH株CDPK1-EF基因,这为研究该基因功能及分布特征等提供了基础。     

鲤春病毒(SVCV)糖蛋白基因的原核表达

通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。