少孢节丛孢菌新疆分离株几丁质酶AO-14基因的克隆表达

利用RT-PCR扩增获得少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶AO-14目的基因片段,对该基因进行克隆和分子特征分析;构建重组表达质粒p ET32a-AO14,转化到大肠杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot分析表达的重组蛋白。结果表明,AO-14基因c DNA全长为1 200 bp,编码399个氨基酸;编码蛋白几丁质酶AO-14属于糖苷水解酶18家族,具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGG和DGXDXDWE,氨基酸序列的第131~139为活性位点所在区域,无信号肽序列。SDS-PAGE分析结果显示,AO-14表达产物的分子质量约为60 ku;Western-blot分析结果表明,重组蛋白可以与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应,证实在大肠杆菌中实现了少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-14基因的表达,为进一步研究少孢节丛孢菌几丁质酶AO-14生物学功能奠定了基础。     

杀线虫真菌--少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶的研究进展

在家畜寄生性线虫的生物控制中,利用带线虫真菌——少孢节丛胞菌在侵染线虫过程中分泌的胞外蛋白酶,固定线虫并降解其体壁已显示出巨大的应用潜力。近年来,国外学者主要研究了杀践虫真菌胞外蛋白酶．特别是对少孢节丛孢简胞外丝氨酸蛋白酶基因PⅡ的分离、测序分析、诱导和利用基因工程技术对该蚤白酶基因克隆和异源表达进行了研究。笔者对杀线虫真菌少胞节丛孢菌的研究进展作了阐述。     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌的超微结构，以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示，少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌，隔膜中央有孔，菌丝细胞一般呈长形竹节状；菌株的捕食器为黏性菌环和菌网，形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝，胞质中含有许多电子密集体，呈大小不等的黑色类圆形颗粒状，多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域，这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

少孢节丛孢菌的分离鉴定及捕食线虫活性研究

为研究新疆地区捕食线虫性真菌的生物活性,本实验采用玉米粉琼脂培养基(CMA)培养分离自新疆不同地区的捕食线虫性真菌,通过对分离株纯培养物的形态学观察和18S rDNA基因序列分析,鉴定4株少孢节丛孢菌,分别命名为XA3、XA6、XD1和XD4。18S rDNA基因遗传进化分析表明,XA3、XA6、XD1和XD4新疆分离株之间同源性较高,与GenBank登录的少孢节丛孢菌CBS289.82株同源性最高,分别为99.6%、99.5%、99.1%和98.9%,与形态学鉴定结果一致。捕食线虫活性测定试验表明,4个分离株在CMA中的捕食率为92.8%～97.6%;体外对绵羊粪便中线虫幼虫的捕食率为90.7%～95.4%,均具有很强的捕食活性。本研究为研究绵羊消化道线虫生物防控制剂奠定基础。     

口服少孢节丛孢菌孢子对家畜粪便中线虫幼虫的杀灭研究

对捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）菌株进行了临床杀家畜寄生性线虫幼虫作用的研究。结果表明：培养的少孢节丛孢菌分生孢子经口饲喂动物后，对粪便中线虫幼虫的杀虫率分别可达96.3％（羊）、96．5％（牛）和97．4％（马）。说明少孢节丛孢菌菌株分生孢子可通过家畜消化道，并保持了其捕食寄生性线虫的能力。研究结果为捕食线虫性真菌的临床应用奠定了重要基础。     

低能氮离子束诱变选育捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌

为获取理想的生物防治捕食线虫性真菌菌株,达到利用自然天敌有效控制家畜寄生性线虫病的目的,作者利用低能氮离子注入诱变捕食线虫性真菌——少孢节丛胞菌(Arthrobotrys oligospora)的分生孢子,测定分生孢子萌发后菌丝的生长速度、产孢能力及菌株对线虫幼虫的捕食率,筛选正突变株。结果表明,低能氮离子束具有诱变少孢节丛孢菌的潜能,诱变后的1株少孢节丛孢菌的生长速度、产孢量和对线虫幼虫的捕食率呈现出了正突变效果。     

少孢节丛孢菌Aoz1基因调控区的发掘及分析

为了确定少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶Aoz1基因的潜在启动子区,试验采用透析膜培养的方法培养出少孢节丛孢菌内蒙古株并提取基因组DNA,与NCBI上Aoz1基因进行比对,选定Aoz1基因上游侧翼长度为2 000 bp的序列(命名为AP1)并据此设计引物,用PCR法扩增该序列并构建至平末端载体后测序,使用启动子在线预测软件Web Promoter Scan Service、NNPP以及CpG岛预测软件EMBOSS对AP1进行生物信息学分析。结果表明:所提取的基因组DNA完整性良好;成功构建出重组平末端质粒PEASY-AP1-Blunt,测序结果正确;通过相应软件预测出AP1含有的启动子基本元件,如TATA框、转录起始位点(TSS位点),以及参与Aoz1基因表达调控的转录因子结合位点Sp1、GHO、E2F、T-Ag和GCF等,同时确定了CpG岛的Obs/Exp值与GC含量的百分比分布。说明AP1序列具有启动子的基本结构和特点,初步确定了少孢节丛孢菌Aoz1基因的潜在启动子区。     

高原地区少孢节丛孢菌超微结构观察

采用玉米粉琼脂培养法,从高原地区(海拔2 000~3 000 m)土壤分离得到一株捕食线虫性真菌,根据其菌丝形态、分生孢子和捕食器官形态等结构特征,鉴定其为少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)。为了进一步了解少孢节丛孢菌形态学特征,对少孢节丛孢菌进行了超微结构观察,结果发现该菌有隔膜,主干菌丝上隔的分布较密集,分布距离不等,分生孢子梗不分支。菌环是由瘤状突起延伸形成弧形而形成,多个菌环接连形成菌网,线虫幼虫是被捕食器菌环或菌网捕获致死。     

新疆石河子地区捕食线虫性真菌的分离鉴定

以山羊捻转血矛线虫第三期幼虫作为诱饵线虫,利用撒布分离法对新疆石河子地区土壤中的捕食线虫性真菌进行分离,并对所分离的捕食线虫性真菌进行了形态学及分子生物学鉴定.结果成功分离出了9株捕食线虫性真菌,其形态学符合少孢节丛孢菌.将分离株5.8S rDNA和ITS2基因序列与国内外已知少孢节丛孢菌菌株的对比分析,证明少孢节丛孢菌新疆分离株具有区域性特征,其捕食活性高于报道的菌株.分离出适合本地区生态环境的当地菌株对以后家畜线虫病的生物防控尤为必要.     

少孢节丛孢菌孢子批量培养及通过动物消化道的试验

试验了捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)孢子批量培养技术、孢子通过兔消化道后的活力及其对绵羊消化液的体外耐受力。结果表明，少孢节丛孢菌孢子最适合以玉米粒为基质批量培养；少孢节丛孢菌的孢子在通过兔消化道后，可以保持存活；并且在体外对绵羊瘤胃液、真胃液、十二指肠液有一定的耐受力。     

捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌理化特性研究

研究了捕食线虫性真菌一少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)的染色特性、分生孢子对外界理化因素的抵抗力以及菌丝对线虫第三期幼虫的吸引作用等。结果表明少孢节丛孢菌用革兰氏、瑞氏、姬姆萨氏液染色都能很好的着色；分生孢子对高温敏感，对抗生素不敏感，高浓度的氢离子或氢氧根离子能杀死分生孢子：但分生孢子耐低温，因此可用低温冷冻法保存捕食线虫性真菌分生孢子，其方法简便易行。首次解决了国内外在捕食线虫性真菌菌种保存中的难题。研究显示菌丝对线虫第三期幼虫无明显吸引力。     

氨基酸对少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)捕食器产生的影响

为了解氨基酸对少孢节丛孢菌产生捕食器的影响,在少孢节丛孢菌的基础,菌丝生长的不同时期将浓度为0.5、0.05、0.005 g.L-1的不同氨基酸溶液均匀加入CMA培养基,观察捕食器的产生情况。结果表明：不同种类氨基酸对少孢节丛孢菌产生捕食器的影响不同,其中以浓度为0.05 g.L-1的L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸、DL-缬氨酸的诱导效果较好;DL-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、DL-亮氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸属于中等;L-赖氨酸、L-谷氨酸和L-组氨酸溶液效果较差。新生菌丝对氨基酸刺激比较敏感,易产生捕食器;与线虫诱导产生的捕食器相比,氨基酸诱导产生的捕食器对虫体的捕食能力无明显变化,可见少孢节丛孢菌在没有线虫诱导的情况下,加入一定浓度某些种类的氨基酸同样可以产生捕食器,并能捕食线虫幼虫。这为深入开展对捕食线虫性真菌生化方面的研究提供了有价值的资料。     

不同环境和营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌生长、产孢及几丁质酶表达的影响

【目的】研究温度、pH和不同营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)生长及产孢特性的影响,分析其在碳氮饥饿条件下几丁质酶的表达水平,优化该菌的培养条件,为该菌的扩大培养提供参考依据。【方法】将圆锥节丛孢菌AC-shz1菌株接种于YPSSA培养基,分别置于不同温度(15、20、25、30和35℃)、pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、碳源(果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、几丁质)、氮源(甘氨酸、苯丙氨酸、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素)和碳氮比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)环境条件下进行培养,观察并记录菌丝的生长速度及形态,测定其产孢能力;在碳氮源饥饿条件下,采用实时荧光定量PCR方法对4种几丁质酶基因的表达水平进行分析。【结果】圆锥节丛孢菌在温度15～30℃均能生长,其中以25℃时菌丝生长最快且产孢能力最强;在pH为6.5～7.5时菌丝生长良好,其中以pH 7.0时产孢能力最强。圆锥节丛孢菌最适菌丝生长和产孢碳源为葡萄糖和蔗糖,其中含葡萄糖的培养基产孢量最高;最适氮源为酵母粉和蛋...     

新疆乌鲁木齐地区捕食性真菌圆锥节丛孢菌的分离鉴定

为了给动物线虫病的防治工作提供适应本地生存的候选捕食性真菌菌株，对新疆乌鲁木齐地区采集的土壤进行筛选，采用土壤撒布法，以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为诱饵线虫对土壤中的捕食性真菌进行分离鉴定，成功分离出具有捕食线虫功能的真菌1株。通过形态学观察，该菌捕食器官为黏性菌网，分生孢子无色，呈圆锥形，中央有一分隔，形态结构与节丛孢属相符。分子生物学分析显示，该分离株的ITS2基因序列与圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)的同源性为99%～100%,判定该菌为圆锥节丛孢菌的新疆分离株。在实验室条件下，利用该菌株进行捕食线虫活力测定，结果发现该菌株在CMA培养基中对马圆形线虫三期幼虫的捕食率为97.47%,具有较强的捕食效率，可作为新疆地区动物线虫病生物防治工作的候选菌株。     

捕食线虫性真菌18S rDNA基因序列与种系发生关系研究

对捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌A1分离株(Arthrobotrys oligospora A1)的18S rDNA基因序列进行了研究。结果表明：其18S rDNA全基因序列为1769bp，在进化树上与同种国外分离株A．oligospora var oligospora 1最为接近，同源性为94．7％。这与二者都具有捕食性结构—菌网的特点相一致。证实捕食线虫性真菌的捕食性结构与捕食线虫性真菌种系发生有关。从少孢节丛孢菌3个分离菌株(Arthrobotrys oligospora A1、A．oligospora 1、A．oligospora2)的进化树及同源性来看。不同国家地区的丛孢菌属(Arthrobotrys)分离株确实存在差异。     

少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物在捕食线虫过程中的作用研究

为了解捕食性真菌——少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物的性质及在捕食线虫过程中的作用,作者首先用氨基酸诱导产生大量捕食器(菌环和菌网)菌丝,然后分别应用5种不同化学性质的溶液、2种酶和7种蛋白酶抑制剂处理捕食器表面聚合物,观察对捕食和致死线虫作用的影响,同时使用上述物质或溶液处理菌丝以确定对菌丝生长的影响。结果表明:5 mol.L-1LiCl溶液和链霉蛋白酶E可明显降低真菌的捕获线虫的能力;0.1 mol.L-1NaOH、SDS-巯基乙醇-尿素PBS溶液、1.5%(w/v)SDS除可抑制捕获虫体外,同时还抑制了真菌菌丝的生长;除菲啰啉外,其余6种酶抑制剂对真菌的黏附捕获作用无明显影响;但其中丝氨酸蛋白酶类抑制剂还可抑制真菌对线虫的致死作用;另外用酶抑制剂处理线虫后,对真菌的黏附捕获作用也无明显影响。上述结果表明少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物在黏附捕获线虫过程中起关键作用,其为蛋白质或含蛋白质类物质;并间接证实黏附捕获阶段不需要蛋白酶参与,但其在致死线虫阶段会发挥重要作用。这为阐明捕食性真菌作用机理提供了非常有价值的资料。     

捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌冻干生物制剂的制备

通过在含有0.05%琼脂粉的沙氏葡萄糖肉汤培养基中培养少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)再转接到玉米粒培养基的方法,对少孢节丛孢菌分生孢子进行培养。在不同时间点,将培养好的分生孢子从培养基上洗脱并进行计数,然后制成冻干制剂,并观察其复苏情况,从而为少孢节丛孢菌冻干制剂的临床应用提供基础数据。结果显示:通过对少孢节丛孢菌冻干制剂在萌发率、生长率和捕食率三方面的复苏情况观察,少孢节丛孢菌冻干后的分生孢子在接种后4d,萌发率达到最大值79.5%,平均生长率为3.4mm/d,加入虫体后7d捕食率最高,为95.8%,平均每天捕食率为74.0%;少孢节丛孢菌冻干制剂在平均生长率和捕食率方面与对照组相比,差异均不显著(P>0.1)。结果表明,冻干制剂材料易得,方法简单易行,复苏效果良好,进一步优化后将具有产业化应用的前景。     

捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌CIMH1株捕食特性研究

本研究首次对国内土壤中分离出的捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌ＣＩＭＨ１株（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｏｌｉｇｏｓｐｏｒａｓｔｒａｉｎ：ＣＩＭＨ１）捕食马线虫第３期幼虫的活性、效力及杀虫机理进行了试验。结果表明菌株生长环境对其捕食活性有很大影响。在２０℃、有氧条件、玉米粉浓度相对较低（０．４ｇ／Ｌ）、菌丝生长较稀疏的ＣＭＡ培养基中,捕食活性最佳。捕食线虫时,在虫体运动刺激及虫体内部某些物质诱导下,菌株会产生一些特殊捕食性结构,如粘性菌丝（Ｓｔｉｃｋｙｂｒａｎｃｈｅｓ）、粘性菌环（Ｓｔｉｃｋｙｒｉｎｇｓ）和粘性菌网（Ｓｔｉｃｋｙｎｅｔｗｏｒｋｓ）等。通过这些功能性构造,菌株将线虫捕获并杀死消化。少孢节丛孢菌ＣＩＭＨ１株在最佳条件下,对马线虫第３期幼虫的平均捕食效力为７８．１５±３．８％。     

节丛孢属食线虫真菌对体外奥斯特线虫幼虫的捕食效果

本文在国内首次报道了几株节丛孢菌食线虫真菌（５株寡节丛孢菌和２株葡萄串状节丛孢菌）在体外对山羊奥斯特线虫第３期幼虫的捕食效果。结果表明：７株真菌对奥斯特线虫幼虫的捕获率分别在７５．０％￣９６．４％之间,具有较高的捕杀线虫能力,食线虫真菌对线虫的作用方式主要是通过在线虫周围形成菌网。     

不同氨基酸对少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）捕食器诱导效果的研究

试验研究了11种氨基酸在玉米粉琼脂培养基上对捕食线虫性真菌——少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）产生捕食器及对线虫第3期幼虫捕食睛况的影响。结果表明：氨基酸可以诱导少孢节丛孢菌产生捕食器,且不同种类氨基酸对其产生捕食器的影响表现不同,各个浓度之间差异明显,其中以浓度为0．05g/L的L-苯丙氨酸（L—Phe）、L-蛋氨酸（L—Met）、DL-缬氨酸（DL—Val）的诱导效果较好;L-苏氨酸（L—Thr）、L-异亮氨酸（L—Leu）、L-亮氨酸（L—Leu）、L-色氨酸（L—Trp）和L-缬氨酸（L—Val）属于中等;L-赖氨酸（L—Lys）、L-谷氨酸（L—Gin）和L-组氨酸（L—His）表现较差。于菌丝生长初期、中期、后期分别加入氨基酸时,不同时期捕食器的产生差异也较为显著,生长初期和生长中期加入氨基酸的试验组捕食器产生良好;前者又明显好于后者。上述现象提示,少孢节丛孢茵在没有线虫诱导的情况下,加入一定浓度的某些种类氨基酸,同样可以刺激其产生大量捕食器。而且捕食情况表明这些捕食器与线虫诱导刺激产生的捕食器一样,完全可以捕食线虫幼虫。