1株猪链球菌的分离·鉴定及其毒力因子研究

[目的]对1株疑似猪链球菌菌株进行鉴定,为进一步研究猪链球菌的毒力提供理论基础。[方法]采用革兰氏染色镜检、形态观察和16S rDNA测序后NCBI数据库Blast比对鉴定菌株;另外选取猪链球菌7种主要毒力因子设计引物,利用PCR方法检测其毒力基因分布情况。[结果]显微镜下该疑似菌株为革兰氏阳性菌,多数呈链状,少见单个排列。16S rDNA测序结果与猪链球菌2型同源性达到99%。毒力因子检测均含有7种毒力因子。[结论]该疑似菌株为猪链球菌2型,其毒力基因型为：gdh＋/ef＋/mrp＋/sly＋/fbps＋/orf2＋/cps2J＋/。     

猪链球菌及其血清型的PCR检测

从广东省部分地区猪场采集疑似猪链球菌病病猪的扁桃体棉拭病料202份,用PCR方法检测棉拭样本培养物中猪链球菌（Streptococcussuis）及其主要致病血清型（1、2、7和9型）．检出阳性样品147份,检出率为72．8％．其中检出S．suis血清2型21份,检出率为12．9％;检出血清9型6份,检出率为3．0％;未检出血清7型和1型．此外,不同地区和不同发育阶段的猪,S．suis检出率和各血清型检出情况也存在较大差异．从而证实广东地区猪群中广泛存在S．suis呈地域性流行,并且是多种血清型共存．     

甘肃省天水市2020年猪链球菌Ⅱ型的流行毒力基因分析

【目的】为了调查甘肃省天水市张家川县的猪链球菌型Ⅱ及毒力基因流行情况,为本市及全省的猪链球菌疫情预警和防控措施制定提供参考。【方法】于2020年1月至2020年12月年从甘肃省天水市张家川县10个规模化猪场定期采集267份猪血清样本,利用从临床样本中分离得-到的18株猪链球菌Ⅱ型病原菌,通过ELISA抗体检测试剂盒特异性检测猪链球菌和猪链球菌Ⅱ型血清抗体水平,并通过PCR测定溶菌酶释放蛋白（muramidasereleased protein,MRP）、胞外因子（extracellular protein fateror,EPF）和溶血素（suilysin,SLY）基因的表达水平。【结果】267份样品中猪链球菌阳性率为26.2%(70/267),猪场阳性率为60%(6/10)。18株猪链球菌Ⅱ型检测到7种毒力基因型。其中,epf+mrp+sly+是此地区优势毒力基因型,其次是epf+mrp-sly+基因型、epf+mrp-sly-基因型和epf-mrp+sly-基因型。【结论】2020年猪链球菌病在甘肃省天水市张家川县流行情况较为严重。     

贵州省铜仁地区猪链球菌2型的分子流行病学分析

目的:调查分析贵州省铜仁地区的猪群中猪链球菌2型的带菌情况和毒力因子的分布情况。方法:研究采用从贵州省铜仁地区各屠宰场收集的150份猪扁桃体样本,对分离菌株进行培养,通过生化鉴定确定当地的猪群带菌情况,并使用PCR方法对猪链球菌2型的主要致病毒力因子进行检测。结果:检测显示,150例样本中2型猪链球菌带菌率达到41.3%,其中屠宰场3的检出率较高,mrp、epf片段与阳性对照相关基因的同源性达到100%,屠宰场3的所有样本mrp、epf毒力因子均表现为阳性。结论:该地区猪群猪链球菌2型携带率较高,mrp、epf毒性因子阳性表现型与疫病的流行可能存在一定的关联性。     

猪链球菌国内分离株毒力因子的分布特征

为了研究国内致病性猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的毒力因子分布特征,本试验选取猪链球菌7种主要毒力因子—谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关序列orf2,设计并合成7对引物,用PCR方法进行检测。结果显示:25株猪链球菌2型(SS2)国内分离株,96%(24/25)表现为cps /gdh /epf /mrp /sly /fbps /orf2 ,仅1株表现为cps /gdh /epf-/mrp /sly /fbps /orf2 ;1株猪链球菌1型(SS1),表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;1株猪链球菌7型(SS7)国内分离株,表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;2株猪链球菌9型(SS9)国内分离株,均表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly-/fbps-/orf2 ,可见国内SS2的毒力基因分布特征与欧美等国家明显不同,提示我国目前SS2的主要流行菌株是同时具有7种毒力因子的高致病菌株。     

检测猪链球菌2型毒力相关蛋白的ELISA法的建立

提纯猪链球菌2型分离株HA9801的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF），制备其抗体。用此抗体建立了Dot-ELISA和间接ELISA检测法。分别以菌株ATCC35246和HA9801为阴性和阳性对照，检测17株猪源链球菌和1株猪链球菌2型人分离株。结果显示，两种ELISA的检测结果一致，MRP和EF的阳性率均为61％（11／18）。     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋/GDH＋,30%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH-,10%为CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY-/GDH＋。【结论】CPS2J＋/MRP＋/EF＋/SLY＋是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。     

猪链球菌分子生物学检测研究进展

猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原.目前,PCR是检测猪链球菌最常用的方法.可以通过扩增猪链球菌特有的基因片段(cps、gdh)等鉴定出猪种链球菌,然而很多新分离的菌株还无法用PCR方法进行鉴定.新的分子生物学检测方法在基因的水平上.对猪链球菌新分离菌株进行定型和阐述猪链球菌毒力株与无毒力株之间的差别的运用发展越来越快.     

用斑马鱼检测猪链球菌2型的致病力

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）菌株致病力各异，以斑马鱼为实验动物，建立了较为简便可靠的SS2致病力检测方法。【方法】选用1 005尾AB系斑马鱼（Danio rerio）以检测SS2不同分离株的致病力。检测8株基因型均为mrp+ef+、对猪有致病力的SS2菌株。【结果】结果斑马鱼接种菌株12 h后呈败血症病变，96 h内对斑马鱼的半数致死量（LD50）在5.36×103至5.01×104 cfu之间。上述接种菌株的斑马鱼均从体内重新分离到接种菌。同时检测1株基因型为mrp-ef-、对猪无致病力的SS2菌株，斑马鱼接种后96 h内不表现任何病变，亦不出现死亡，对斑马鱼的LD50>106 cfu。SS2有毒力株和无毒力株对斑马鱼的LD50差异极显著（P＜0.01）。【结论】斑马鱼可作为研究猪链球菌2型菌株感染的动物模型。     

鹿魏氏梭菌分离鉴定及部分生物学特性的研究

对猝死鹿脏器中分离的２４株魏氏梭菌进行研究表明：８７．５％（２１／２４）分离株为血清Ａ型,１２．５％（３／２４）分离株为血清Ｃ型。经毒力测定,筛选出了３株产毒素强的菌株,该项研究为魏氏梭菌疫苗研制奠定了基础。     

Vaccination of Plasmid DNA Encoding Somatostatin Gene Fused with GP5 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Induces Anti-GP5 Antibodies and Promotes Growth Performance in Immunized Pigs

Somatostatin （SS） is a hormone that inhibits the secretion of growth hormone. Immunization against SS can promote the growth of animals. This paper described the effects of DNA immunization on the growth and antibody response in mice and pigs immunized with a plasmid DNA encoding SS fused with GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）. A fragment of 180 bp encoding partial SS gene was amplified by PCR from the genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells of pigs, and cloned as a fusion gene with PRRSV GP5 in plasmid pISGRTK3. Three times of immunization with the resulting plasmid pISG-SS/GP5 induced anti-GP5 antibodies in BALB/c mice and pigs, as demonstrated by GP5-specific ELISA and immunoblotting. Compared with pigs immunized with empty vector pISGRTK3, the growth performance of pigs immunized with pISG-SS/GP5 was increased by 11.1% on the 13th week after the last vaccination. The results indicated the plasmid DNA encoding SS and PRRSV GP5 fusion gene elicited anti-GP5 antibodies and improved the growth performance of immunized pigs.     

生长抑素基因在猪胃组织中表达发育性变化及品种比较

 选用生长速度快的瘦肉型猪大白猪和生长速度慢的肥胖型猪二花脸作为试验动物 ,用相对定量RT PCR方法 ,研究猪胃体部组织中生长抑素 (somatostatin ,SS)基因表达发育性变化并进行品种间比较。结果表明 ,(1)出生当天两品种猪胃体部组织中SSmRNA表达水平较高 ,但出生后第 3天均出现显著下降 (P <0 .0 5 ) ;(2 )从 3日龄到 30日龄胃体部组织中SSmRNA表达在二花脸猪和大白猪均表现为上升 ,二花脸猪在 90日龄时达到高峰 ,随后下降。而大白猪在 30日龄之后保持相对稳定 ;(3)二花脸猪胃体组织中SSmRNA表达从出生到 90日龄均显著高于大白猪 (P <0 .0 5 ) ,二花脸猪胃体组织中SS表达自 12 0日龄下调 ,12 0～ 180日龄期间大白猪和二花脸猪胃体部SSmRNA表达没有间差异 (P >0 .0 5 )。以上结果提示 ,猪胃体部组织中SS基因表达调控有特定的时序性 ,并且呈现显著的品种差异 ,这是否与胃结构和功能的发育有关 ,还有待进一步研究。     

猪源2型链球菌福建株CPS2J基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌CPS基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测CPS2J基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下：应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg 细菌DNA;SS2PFJ06CPS2J 基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%-100%和97.8%~100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌CPS2J基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测; 序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。     

PRV和PCV2二重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)2种病毒的多重PCR,设计2对PRV和PCV2特异性引物,建立同时检测这2种病毒的二重PCR方法,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果表明,PRV和PCV2扩增产物分别为359bp和482bp,最小DNA质量分别是2.7pg和4.3pg。采自河南省的80份样品的总阳性率为85%(68/80),其中PRV和PCV2阳性率分别为28.8%(23/80)和77.5%(62/80),混合感染率达25%(17/68)。该多重PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品PRV和PCV2检测。     

猪链球菌2型广西分离株毒力基因表型分析

【目的】了解广西致病性猪链球菌2型（SS2）菌株的毒力基因表型,为广西SS2的防制提供分子生物学依据。【方法】应用PCR技术对分离自发病猪的SS2菌株进行荚膜多糖糖基转移酶基因（CPS2J）、溶菌酶释放蛋白基因（MRP）、细胞外蛋白因子基因（EF）、溶血素基因（SLY）和谷氨酸脱氢酶基因（GDH）5种毒力基因检测。【结果】60%菌株的基因表型为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY+/GDH+,30%为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY-/GDH-,10%为CPS2J+/MRP+/EF+/SLY-/GDH+。【结论】CPS2J+/MRP+/EF+/SLY+是广西致病性SS2菌株的主要基因表型,与从江苏、四川SS2疫区分离获得的菌株基因表型一致,今后应加强对SS2毒力基因的监测,严防SS2疫情暴发。     

Investigation on the co-infections of Toxoplasma gondii with PRRSV,CSFV or PCV-2 in swine in part of China

The objective of the present investigation was to estimate the prevalence of Toxoplasma gondii infection and co-infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), classical swine fever virus(CSFV) and porcine circovirus type 2(PCV-2) in pigs in China. A total of 372 tissues or serum samples collected from pigs distributed in 9 provinces/municipalities of China during the period from February 2011 to November 2012 were assayed for T. gondii antigens and antibodies using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) technique, while the PCR was designed for the detection of the PRRSV, CSFV and PCV-2, respectively. The total positive rate of T. gondii, PRSSV, CSFV and PCV-2 was 9.14%(34/372), 50.00%(186/372), 37.10%(138/372) and 3.23%(12/372), respectively. Among the 34 T. gondii positive samples, 26 samples were simultaneously infected with T. gondii and viruses, while the remaining eight samples were infected with T. gondii alone. In addition, the co-infection rate of T. gondii with PRSSV, T. gondii with PRSSV and CSFV, T. gondii with PRSSV and PCV-2, T. gondii with CSFV and PCV-2, T. gondii with PRSSV, CSFV and PCV-2 was 1.61%(6/372), 4.03%(15/372), 0.27%(1/372), 0.27%(1/372) and 0.81%(3/372), respectively. The results of the present survey revealed that PRRSV and CSFV were the common pathogens co-existing with porcine toxoplasmosis in China, and both of them could increase the chances of T. gondii infection in pig. This is the first report of T. gondii co-infections with viruses in pigs. It is very important to understand the interactions of parasite and virus, and can be used as reference data for the control and prevention of co-infections of T. gondii and viruses in pigs.     

浙江地区猪圆环病毒2型检测及遗传变异分析

为了掌握浙江地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法,对2018年浙江地区猪场采集的临床疑似病料进行PCV2检测,并对部分阳性病料进行全基因扩增、克隆、序列测定和ORF2遗传进化树分析。结果显示:329份临床疑似样品中,PCV2阳性率27.4%(90/329),其中宁波地区阳性率最高,为52%;保育猪和肥育猪阳性率最高,分别为38.8%(64/165)和68.8%(11/16)。选取7份病料进行全基因组扩增,每个毒株随机挑选3个或4个阳性克隆进行序列测定,共得到22个毒株进行遗传变异分析。22株病株同源性为93.3%~99.8%,与16个参考毒株同源性为93.5%~99.8%。根据遗传进化树分析,22个毒株分别处于3个分支,其中6株PCV2a,6株PCV2b,10株PCV2d,说明目前浙江地区PCV2d是优势毒株。ORF2遗传进化树分析显示,ORF2核苷酸同源性较全基因组核苷酸同源性低, 3个分支分别处于PCV2b、PCV2d和PCV2e,预示浙江地区流行毒株可能在向PCV2e转变。本研究掌握了PCV2在浙江地区的流行动态,为浙江省PCV2疫苗株的选择和疫苗研发提供了理论依据。     

鲁西地区猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查

[目的]为调查鲁西地区猪传染性胸膜肺炎病的流行状况,建立了检测胸膜肺炎线杆菌（Aetinobacillus pleuropnemunoniae,APP）的PCR方法。[方法]利用PCR方法对186头病死猪的病变组织及545头无临床症状健康猪群进行了APP的流行病学研究。[结果]186份病料中APP阳性率占43．0％（80／186）,545份猪血清APP阳性占7．9％（43／545）。[结论]该PCR方法可作为APP临床诊断的重要手段之一。