猪精子结合和内化外源基因的影响因素研究

精子介导基因转移(SMGT)是目前转基因动物研究中简单而高效的方法之一,其中精子结合和内化外源基因的效率是精子介导转基因成功的关键.本试验以DIG标记的线性化EGFP作为示踪基因来检测猪精子结合和内化外源基因的影响因素,结果表明:猪精子能够自发结合外源基因,结合部位主要在精子顶体后区.精子结合外源DNA的阳性率随共孵育时间延长而增加,在37℃或39℃时孵育60 min后,阳性率不再增加;在17℃时孵育90min后,阳性率不再增加.在检查的15只公猪样本中,精子与外源DNA的结合率为6.57%～35.81%,内化率为2.99%～24.66%,个体间差异显著(P<0.01).精浆能够强烈抑制外源基因的结合和内化,脂质体及DMSO能够显著提高转染效率.死精子能够结合外源基因,但不能将其内化;反复冻融导致质膜破裂的精子对外源基因有更高的结合率,且不受个体影响.     

纳米化聚酰胺-胺型树枝状聚合物对猪精子介导基因转移效率的影响

为优化猪精子介导的基因转移(SMGT)技术,提高转基因效率,本试验利用纳米化聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM-D)为载体介导猪精子转染外源DNA,经原位杂交检测其阳性率,体外受精(IVF)分析外源基因的表达.结果显示,0.5 μg线状质粒DNA中加入PAMAM-D(质量比20∶1)阳性率最高(P＜0.05)；孵育时间为90、120min时,阳性率显著高于30、60 min组(19.94％、18.57％与8.50％、13.87％；P＜0.05)；以此条件处理精子,阳性率显著高于无载体和脂质体处理组(23.93％与7.25％0、13.25％；P＜0.05).各处理精子经IVF后,PAMAM-D组EGFP表达率显著高于其他2组(9.19％与4.81％、3.43％;P＜0.05),各组绿色荧光胚胎经基因组PCR分析均能检测到EGFP基因.结果表明,PAMAM-D可有效介导猪精子转染外源DNA,并通过体外受精将外源基因导入胚胎中.     

精子介导法制备转基因鸡的研究

以LacZ基因为报告基因，构建载体质粒p-OV-β-Gal，转移到鸡早期胚胎内，对外源基因的整合及表达情况进行检测分析，为制备转基因鸡探索新的方法。采用脂质体介导法、精子介导法以及电激法相结合的方法将载体质粒p-OV-β-Gal转移到鸡早期胚胎内，进行转基因鸡研究，结果发现其外源基因整合阳性率为13.2%（7/53），表达阳性率为20.7%（11/53）。说明该方法可作为制备转基因鸡的有效方法。     

精子载体法获得转人her2基因猪

将带有外源基因的载体酶切纯化后与去精清的猪新鲜精液按比例混合，17℃静置处理使外源DNA进入精子头部，通过人工授精使受体母猪怀孕后产下20头仔猪，经PCR特异性片段扩增，特异片段序列测定和比对，共4头PCR结果为阳性。初步证明人her2基因已在猪染色体上整合，其整合率约为20％。本研究利用精子载体法成功获得了转基因阳性猪，为大动物的转基因研究提供了理论与实践的参考。     

转pGH IGF-1基因对猪生长和繁殖性能的影响

为了解转双基因在猪生长发育中作用及意义,选取23头健康仔猪,其中转p GH、IGF-1双基因猪4头,转p GH基因猪12头,非转基因猪7头,研究p GH、IGF-1基因对猪生长和繁殖性能的影响。结果表明,转p GH、IGF-1双基因猪个体均重比转p GH单基因猪高2.83%,差异显著(P0.05);转双基因猪比非转基因猪高7.37%,差异显著(P0.05)。转双基因猪体重达100 kg的日龄比转单基因猪少8.93 d,差异显著(P0.05),转双基因猪比非转基因猪少12.23 d,差异显著(P0.05),转单基因猪比非转基因猪少3.30 d,差异不显著(P0.05);转双基因公猪的精液量,分别比转p GH单基因公猪与非转基因公猪提高27.61%、18.31%,差异均显著(P0.05);精子密度,三者之间差异均不显著(P0.05);转双基因公猪与非转基因猪的精子活力之间差异不显著(P0.05);转单基因公猪畸形率分别比转双基因公猪、非转基因猪高23%、18%,差异均显著(P0.05)。为进一步分析p GH-IGF-1生长轴对家猪生产性能的具体影响提供参考依据,也为转基因技术的推广与应用提供有力依据。     

睾丸注射转基因技术研究进展

睾丸注射法将外源DNA直接注入睾丸内转染各级生精细胞,通过生精细胞的增殖分化而获得大量转基因精子,通过人工授精或自然交配生产转基因动物,是一种操作简便、成本低和适宜于大群生产的精子介导的转基因方法。本文对睾丸注射法获得转基因精子的原理以及曲精细管注射法、睾丸间质注射法和睾丸网注射法3种睾丸注射方法进行介绍,对睾丸注射制备转基因动物所应用的阳离子脂质体介导法、高分子载体介导法、二甲基亚砜(DMSO)介导法和电穿孔法、基因枪法5种转染方法进行综述,并指出了睾丸注射法存在的问题,对睾丸注射法的研究前景进行了展望。     

精子载体转基因技术研究进展

精子因在受精过程中的独特作用,而被公认为是转移外源DNA的理想载体,且操作简便,成本低廉,危险隐患相对较低,近十几年来的研究结果表明精子载体介导法可以得到转基因阳性动物.本文对精子载体转基因方法、精子载体转基因的机理、影响精子与外源DNA结合的因素以及外源DNA在宿主动物中的存在形式等方面进行了论述,并对精子作为载体的研究方向和前景给予了预测.     

精子结合与内化外源DNA的分子机制研究进展

精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力,并能在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物。精子介导基因转移(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一,但该方法存在着极大的随机性和不确定性。研究精子结合与内化外源DNA的分子机制、外源DNA进入精子后的定位及命运,对提高利用SMGT方法生产转基因动物效率和稳定性是十分重要的。精子与外源DNA的结合、内化和整合是受到严格调控的一种现象。     

猪基因导入研究中两种转基因方法的比较

供试受体母猪共87头,其中50头受体母猪用显微注射法获得转基因卵。37头受体母猪采用精子载体法通过人工手术输精使其受孕。其受胎率前者为63.24％,后者为30.87％;平均产仔数分别为5.38和6.18头;基因整合阳性率分别为17.9％和12.7％;转基因效率分别为2.7％和2.8％。两种方法,平均产仔数.基因整合阳性率及转基因效率之间差异不显著(P>0.05),而受胎率之间差异极显著(P<0.01)。用精子载体法导入外源基因,不需对胚胎进行体外显微操作,大大简化了生产转基因动物的程序.但此方法尚需逐步完善。     

单精注射法生产转GFP基因猪胚胎的研究

卵胞质内单精子注射(ICSI)的出现为治疗人类男性不育提供了新的途径。作为一种家畜胚胎工程新技术，ICSI可以解决猪的多精子受精问题。本研究用冷冻/解冻的猪精子与GFP基因孵育后对猪IVM卵母细胞进行ICSI，通过对猪ICSI卵母细胞发育能力和基因表达效率的分析，初步研究以精子为载体的转基因与卵细胞质内单精注射相结合的技术(SMGT-ICSI)生产转基因猪胚胎的技术路线的可行性。用GFP基因转染的精子注射后化学激活的ICSI卵母细胞基因表达率显著高于电激活处理的ICSI卵母细胞的基因表达率。用精子头部注射的猪卵母细胞和用完整精子注射的猪卵母细胞总基因表达效率无显著差异(P>0.05)。结果表明，用冷冻/解冻后的猪精子或精子头部与外源DNA孵育后通过ICSI方法生产转基因胚胎是可行的。