猪乳腺干细胞的分离培养及EGFP基因转化

利用乳腺干细胞培养技术体系,从成年猪乳腺组织中分离培养乳腺干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入乳腺干细胞,诱导转基因乳腺干细胞向乳腺上皮细胞分化,观察其分化特点。结果成功分离培养出乳腺干细胞,获得转EGFP基因乳腺干细胞,它们在表达EGFP的同时仍具有分化潜能,能分化成梭形和扁平状细胞。结果表明,从成年猪乳腺组织中分离乳腺干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因乳腺干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP基因对乳腺干细胞进行标记、追踪,为EGFP基因作为示踪标记对乳腺干细胞用于体内移植研究奠定了基础。     

妊娠中期猪胎儿神经干细胞分离培养及分化

从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志.结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果表明,从妊娠中期猪胎儿脑组织可以分离神经干细胞,神经干细胞具有自我更新和分化潜能.     

猪胎儿神经干细胞的分离培养和分化

本研究旨在从猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,观察神经干细胞生长特性和体外增殖、分化特点.利用神经干细胞培养体系,从胎龄30 d的猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞并诱导神经干细胞贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因.结果成功分离培养出神经干细胞,神经干细胞具有分化潜能.神经干细胞中Nestin表达强阳性,β-actin、DCX、Hesl、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果提示,从猪胎儿脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,神经干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能.     

绵羊羊水、胎儿肾脏组织中表达Oct-4细胞的分离培养及其分子学特性研究简

试验旨在建立从绵羊羊水、胎儿肾脏组织中分离培养表达Oct-4细胞的新方法,同时,通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）初步探索二者在分子生物学特性方面的联系及差异。采用0.01%胰酶培养液,从同一只受孕中期绵羊的羊水和胎儿肾脏组织中各分离1株细胞。Real-time PCR分析结果表明,从绵羊羊水、胎儿肾脏组织中分离的细胞均表达胚胎干细胞相关标志基因Oct-4、胚胎生殖细胞标志基因SSEA-1、主要组织相容性抗原MHC-Ⅱ、细胞凋亡基因Bax及抑制细胞凋亡基因Bcl-2,不表达MHC-Ⅰ、Nanog及TERT,因此,将羊水中表达Oct-4的细胞暂命名为羊水来源多潜能干细胞(amniotic fluid stem cells,AFSC),胎儿肾脏组织中表达Oct-4的细胞暂命名为肾脏组织干细胞(renal tissue stem cells,RTSC)。相对定量分析结果显示,二者的Oct-4、Bax及Bcl-2基因的相对表达量存在明显差异。绵羊羊水中表达Oct-4的细胞（AFSC）和胎儿肾脏组织中表达Oct-4的细胞（RTSC）体外悬浮培养7 d均能形成类胚体。试验成功建立了从绵羊羊水、胎儿肾脏组织中分离培养表达Oct-4细胞的新方法,实时荧光定量PCR分析初步显示绵羊羊水中表达Oct-4的细胞和胎儿肾脏组织中表达Oct-4的细胞具有相同的起源,并在体内处于一种动态的变化之中。     

绵羊羊水干细胞外源基因高效转染及快速筛选方法的建立

试验旨在建立绵羊羊水来源多潜能干细胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFSC)外源基因高效转染及快速筛选方法,同时保持其多潜能特性。采用脂质体法,以pCMV-DsRed为报告质粒,转染绵羊AFSC,36 h后,流式细胞仪分析外源基因的瞬时转染效率为69.17%。以浓度为6 mg/mL的G418筛选5 h获得纯化转基因绵羊AFSC单克隆。转基因绵羊AFSC RT-PCR检测表达Oct-4、SSEA-1,体外悬浮培养可形成类胚体。结果表明,转基因标记绵羊AFSC保持了发育全能性的潜能,构建的转基因绵羊AFSC可以示踪性研究其在体内的分化路径和最终宿主。     

鸡脑神经干细胞体外诱导分化研究

为了研究鸡脑神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外的分离、培养及诱导分化等生物学特性,试验采用机械吹打法分离鸡脑神经干细胞,通过免疫荧光对体外培养鸡脑神经干细胞进行表面标记检测,并在适宜的诱导条件下向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞三个方向进行诱导,检测其多向分化潜能。结果表明:体外分离培养的鸡NSCs为目的细胞,并可向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞诱导分化。说明鸡脑NSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。     

猪乳腺细胞分离培养及EGFP基因转化

本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞.利用乳腺细胞堵养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞.结果,从成年猪乳腺组织中成功分离培养出上皮细胞和成纤维细胞,获得转EGFP基因上皮细胞和成纤维细胞.上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚,比较明显.成纤维细胞呈长梭形.结果表明,可以从猪乳腺组织中分离上皮细胞和成纤维细胞,EGFP可以在这些细胞中表达.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及肝内示踪

通过分离培养兔骨髓来源的间充质干细胞(MSCs),示踪其肝内移植命运,为MSCs的细胞治疗肝脏疾病提供理论依据和试验支持.采取全骨髓贴壁培养法分离培养兔骨髓MSCs,利用携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体感染MSCs,选择最优转染效率,并移植入经D-氨基半乳糖诱导的急性/亚急性肝衰竭受体兔体内,荧光显微镜下...     

荷斯坦牛羊水来源干细胞分离培养及其表面标志检测

利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄285 d荷斯坦奶牛胎儿羊水中分离培养干细胞;采用RT-PCR技术检测干细胞表面标志或相关基因。成功分离培养出奶牛羊水来源干细胞,干细胞中CD-90、Nanog、Oct4、TERT、Sox2、Desmin和HES1表达阳性。从奶牛胎儿羊水中分离干细胞具有可行性和有效性,为进行转基因研究提供靶细胞奠定了基础。     

胎牛视网膜干细胞向神经细胞诱导研究

旨在研究胎牛视网膜干细胞(Retinal stem cells,RSCs)的分离、培养、鉴定及向不同类型细胞诱导分化等的生物学特性。采用机械吹打法从胎牛眼睫状体部细胞中分离RSCs,通过免疫荧光方法鉴定RSCs标志物Nestin、Pax-6和Chx-10,并诱导其向星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,机械吹打法获得的胎牛RSCs不仅表达干细胞特有的标志,而且成功诱导分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞。综上表明,胎牛RSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。为今后视网膜干细胞的研究提供相应的理论依据。     

Neurogenic Differentiation of EGFP Gene Transfected Amniotic Fluid‐Derived Stem Cells from Pigs at Intermediate and Late Gestational Ages

The aims of this study were (i) to determine whether amniotic fluid‐derived stem cells (amniotic fluid‐derived stem; AFS cells) could be isolated from pigs at intermediate and late gestational ages, and (ii) to determine if these AFS cells could be differentiated in vitro into neural lineages following transfection with a reporter gene, enhanced green fluorescence protein (EGFP). Amniotic fluid‐derived stem cells were isolated from embryonic day 60 and day 110 porcine amniotic fluid respectively, and transfected with EGFP gene using lipofection. The transfected AFS cells were induced to differentiate into cells of neuronal lineages. Markers associated with undifferentiated AFS cells and their neural derivatives were tested by polymerase chain reaction. The results demonstrated that porcine AFS cells could be isolated at intermediate and late gestational ages and that transfected AFS expressed EGFP and could be induced to differentiate in vitro. Undifferentiated AFS cells expressed POU5F1, THY1 and SOX2, while following differentiation cells expressed markers for astrocytes (GFAP), oligodendrocytes (GALC) and neurons (NF, ENOS and MAP2).     

蒙古羊羊水源干细胞分离培养及其成骨分化研究

试验旨在建立羊水源干细胞系并对其诱导形成成骨细胞的潜能进行研究。在胎牛血清浓度为15%的条件下对羊水源干细胞进行建系,并检测其类胚体形成能力;检测不同代数细胞的干细胞标志基因Oct-4、SH2、SSEA-1、Nanog、HLA-ABC、CD117的表达情况;利用地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸等因子进行诱导。结果表明,羊水源干细胞在体外可以持续增殖,悬浮培养形成的类胚体表达三胚层相关标记基因,经诱导可形成成骨细胞。试验成功分离了蒙古羊的羊水源干细胞并建系,且其具有向成骨细胞分化的潜能。     

鸡胚胎干细胞的分离及其嵌合体制备条件探索

分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后,进行碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1染色鉴定;并用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs。受体种蛋经赤道面开窗后,将经转染的ESCs注射到受体鸡胚胚下腔,以便制作嵌合体鸡;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:5只存活的的嵌合体鸡血液中没有发生EGFP基因嵌合,但有4只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中有2只鸡的性腺发生嵌合,表明利用赤道面开窗后对受体鸡进行胚下腔显微注射可以生产嵌合体鸡。     

联合表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因病毒样颗粒获得及免疫原性

将包含有完整阅读框架,长1 740、705 bp的PPV VP2基因、PCV2 ORF2基因分别插入真核表达栽体pPI-2.EGFP,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.观察由脂质体介导转染重组质粒后的Vero细胞,结果最早在转染后20 h左右出现荧光,36 h达到高峰;对转染细胞进行电镜检测,结果观察到病毒样颗粒存在.为证实所获病毒样颗粒是否为重组颗粒,将纯化后的病毒样颗粒免疫仔猪,检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平.结果免疫仔猪的CD3+、CD4+T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高;CD8+T淋巴细胞在免疫后7～14 d有所下降,之后再升高.抗体检测结果表明,免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体.结果表明重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2获得成功表达并形成重组病毒样颗粒,且该颗粒具有良好的免疫原性.     

利用TALENs技术建立基因定点修饰的猪Oct-4-EGFP细胞系

本研究旨在建立一个用于干细胞示踪的报告体系,将EGFP cDNA及两侧带有LoxP位点的neo抗性基因插入五指山小型猪内源性Oct-4基因的终止密码子处,以Oct-4基因完整的5'调控区启动EGFP的表达,为猪干细胞研究提供有价值的工具。试验定制了针对猪Oct-4终止密码子的TALENs,与打靶载体共转染猪耳成纤维细胞,药物筛选得到抗性克隆点514个,经过PCR鉴定,共获得杂合阳性克隆点36个,打靶效率分别为5.6%和13.0%。本研究成功获得了Oct-4-EGFP转基因细胞系,并证明了TALENs技术可以明显提高同源重组效率。