猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌的制备及其免疫原性分析

为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87 ku的重组蛋白.Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应.大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验.结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础.     

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D_{600 nm}值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸＋0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3~4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×10⁴ CFU/μg DNA。     

猪A组轮状病毒pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的构建及表达

以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析.结果表明,在MRS培养基中加入1％甘氨酸+0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3～4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA. pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

猪轮状病毒Vp4全基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板，应用优化的反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）技术，扩增了2331 bp的Vp4全长基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中，构建质粒pGEM-T-Vp4。以SalⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM—T—Vp4．和以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t，并将纯化的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425t中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp4。将pW425t-Vp4转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli X13中，通过生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87.67Ku融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性，研究结果为pW425t-Vp4在乳酸菌受体菌株中表达提供科学依据。     

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-VpC,并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotaviras），作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行，每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。     

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal I和Kpn I双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thvmidvlatesynthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp4,并将pW425et-VP4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

猪A组轮状病毒Vp4全基因在MA-104细胞中的表达与DNA疫苗的研究

本研究采用Lipofectamine^TM2000将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4染至MA-104细胞中，得到了表达。以荧光抗体检测法和RT-PcR法双重检测了真核重组表达质粒pVAXI-Vp4在MA-104细胞中的表达情况。并将pVAXI-Vp4免疫BALB／c鼠，检测其血清抗体和脾脏中的淋巴细胞增殖情况及CD4^＋，CD8^＋T细胞的数量变化情况。结果表明，猪A组轮状病毒Vp4全基因不但在哺乳动物细胞中获得了表达，而且将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4给动物免疫后，获得了免疫效果。这为pVAXI-Vp4 DNA核酸疫苗的进一步推广应用提供了科学依据。     

BALB/c近交系小鼠的RAPD分析

采用随机扩增多态 DNA(RAPD)技术 ,分析了 BAL B/c近交系小鼠的基因多态性。结果表明 ,BAL B/c近交系小鼠表现出了多态性 RAPD标记 ,单个随机引物扩增的 DNA片段数目为 2至 11条不等 ,片段大小在 30 0～ 2 30 0 bp之间     

应用BALB／c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB／c小鼠，同时设空白对照组，每组8只。免疫后每7d采血一次，用液相阻断ELISA（LPB-ELISA）检测血清抗体水平；第28d用800LD50同源强毒攻击，攻毒后36h，每组随机选取3只BALB／c小鼠，采全血，分别用每只BALg／c小鼠全血注射12只乳鼠，每组共注射36只乳鼠，以乳鼠试验判定BALB／c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明，免疫组BALB／c小鼠均可产生特异性抗体，保护率分别为75．0％、63．9％、36．1％；对照组小鼠血清抗体为阴性。提示，BALB／c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

猪A组轮状病毒VP4全基因在大肠杆菌中的表达与检测

以猪轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了2331bp的VP4全基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-VP4.以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pGEM-T-VP4和pGEX-6P-1,并将纯化的VP4基因亚克隆至融合型表达载体pGEX-6P-1中,构建出原核表达质粒pGEX-6P-VP4.将pGEX-6P-VP4转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约111.47 ku融合蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有轮状病毒抗原性,从而为进一步研究轮状病毒的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.     

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型（PCV2）经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次.BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4^＋、CD8^＋、CD3^＋T淋巴细胞及CD19^＋B淋巴细胞数量显著减少.裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变.结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感.     

Immune response and protective efficacy against homologous challenge in BALB/c mice vaccinated with DNA vaccine encoding Toxoplasma gondii actin depolymerizing factor gene

A DNA vaccine (pVAX1-TgADF) encoding Toxoplasma gondii actin depolymerizing factor (ADF) gene was constructed and the immune response and protective efficacy of this vaccine against homologous challenge in BALB/c mice were evaluated. High titers of specific antibody and increases in the percentage of CD4(+) and CD8(+) T lymphocyte cells were observed from BALB/c mice vaccinated with pVAX1-TgADF (P<0.05), when PBS group was used as control. The survival time of BALB/c mice in pVAX1-TgADF group was longer than those in control groups. The numbers of brain cysts in the experimental BALB/c mice immunized with pVAX1-TgADF reduced significantly compared with those in PBS group (P<0.05), and the rate of reduction could reach to around 42.8%. These results suggested that the DNA vaccine pVAX1-TgADF could generate specific humoral and cellular immune responses, prolong survival times, and reduce brain cysts load against T. gondii infection in BALB/c mice.     

Viral replication and lesions in BALB/c mice experimentally inoculated with porcine circovirus isolated from a pig with postweaning multisystemic wasting disease

Eight-week-old BALB/c mice were either sham inoculated (control mice) or were inoculated intraperitoneally (IP) and intranasally (IN) with a single (sPCV mice) or multiple (mPCV mice) doses of porcine circovirus 2 (PCV2). Four control mice and 4 sPCV mice were sacrificed 7, 14, 28, and 42 days postinoculation (PI). All 4 mPCV mice were sacrificed 42 days PI. In addition, 7-day and 14-day pregnant BALB/c mice were either sham inoculated (control mice) or were inoculated IP and IN with a single dose of PCV2. Newborn mice were euthanatized 1, 8, and 15 days after birth. Necropsies were performed on all euthanatized mice and tissues were collected for histopathology, electron microscopy, in situ hybridization, and polymerase chain reaction (PCR). PCV2 replicated in 8-week-old BALB/c mice that were inoculated with PCV2 and caused fetal infection when inoculated into pregnant BALB/c mice at 7 days and 14 days of gestation. PCV was detected by in situ hybridization and PCR in sPCV mice on days 7, 14, 28, and 42 PI; in mPCV mice on day 42 PI; and in newborn mice from mothers inoculated with PCV at 7 days and 14 days of gestation at 1, 8, and 15 days after birth, but not in control mice. No clinical signs or gross lesions were found in sPCV or mPCV mice during the study. Microscopic lesions in sPCV mice and mPCV mice were characterized by expansion of germinal centers in lymphoid organs with large numbers of histiocytic cells and lymphoblasts, apoptosis of histiocytic cells in germinal centers, and mild lymphoid depletion of the paracortex. PCV nucleic acid was detected in the nuclei and cytoplasm of histiocytes and apoptotic cells in germinal centers in lymphoid tissues as well as in the nuclei of hepatocytes in the liver, in the nuclei of renal tubular epithelial cells, and in the cytoplasm of single lymphocytes in the thymus. Congenitally infected mice only had PCV nucleic acid detected in putative Kupffer cells in livers.     

重组新城疫病毒HN基因乳酸菌抑制结肠癌作用评价

为评价重组新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因植物乳杆菌对鼠结肠癌(CRC)潜在的抑制作用,试验以前期构建的可表达NDV HN基因的植物乳杆菌(简称重组菌HN/Lab)为研究对象,通过肿瘤诱导建立小鼠CRC皮下移植瘤模型,通过腹部手术建立小鼠原位移植瘤模型,并在肿瘤诱导前后给荷瘤鼠灌胃重组菌和不表达HN基因的植物乳杆菌(L.p),通过监测肿瘤体积、荷瘤鼠的存活率以及肿瘤组织的病理学来评价重组菌对CRC的抑制作用。结果表明,试验分别成功建立了小鼠CRC皮下移植瘤和原位移植瘤模型;重组菌(CT26+HN/Lab组)能明显抑制荷瘤鼠皮下肿瘤的生长,分别在肿瘤诱导后25,30 d差异显著(P0.05),重组菌组小鼠的存活率和生存时间也显著高于CT26组(P0.05);重组菌对小鼠原位移植瘤模型抑制效果明显,在肿瘤诱导7 d后即能明显抑制肿瘤的生长(P0.05),抑瘤率为43.13%,与植物乳杆菌(CT26+L.p组)23.03%抑瘤率相比有了明显的提高;病理组织学观察结果显示,重组菌诱导肿瘤坏死明显,浸润的淋巴细胞数量增多,能够抑制肿瘤细胞向黏膜层转移。因此,NDV HN基因重组乳酸菌对鼠CRC模型具有较好的抑制作用。     

A群猪轮状病毒JS株vp7基因序列分析

根据已发表的猪轮状病毒OSU毒株vp7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计一对特异引物,以猪轮状病毒JS毒株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1000 bp目的片段。将其进行T-A克隆、序列测定和分析。结果表明,vp7基因全长1062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与已知的15个毒株vp7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为74.5%～78.5%和75.2%～83.1%,核苷酸系统发育进化树结果表明,JS毒株与轮状病毒G9型参考毒株ICB2185、O-1亲缘关系较近,分为一个群,表明JS毒株血清型为G9型。目前,我国尚未见猪及其它动物轮状病毒G9型流行株的报道。