猪伪狂犬病病毒gD基因的生物信息学分析

自测12条PRV不同毒株的gD全序列连同GeneBank中登录的9条gD基因全序列共21条基因序列,使用生物软件对它们的基因序列的同源性、突变区域的定位、遗传进化关系、酶切位点的差异、密码子偏爱性,氨基酸序列的同源性、蛋白质亲水性、抗原表位分析、三级结构预测等生物信息学的内容进行预测和分析.结果表明:PRV-gD基因的开放阅读框的核苷酸长度在1 197～1 215 nt之间,氨基酸长度在399～405个之间,核酸同源性在97.3%～100%之间,氨基酸的同源性在89.8%～98.8%之间,在核酸820～837位有个高变重复区,不同毒株基因均对GC极为偏爱.在遗传进化关系上将我国PRV流行分为四川、华北、东南3个区域.毒株间基因内酶切位点、蛋白质亲水性、抗原表位和蛋白质高级结构预测等内容的分析结果十分相似,说明PRV-gD基因具有很高的保守性.     

猪伪狂犬病病毒SL株TK基因的克隆与生物信息学分析

本试验对伪狂犬病病毒SL株(四川分离株)TK基因进行克隆,并对TK基因的同源性、遗传进化树、密码子偏嗜性、氨基酸结构及亲疏水性、跨膜区、信号肽进行了分析。结果显示,本研究成功克隆了PRV SL株TK全基因,其编码区长963 bp,编码320个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性超过99.3%,编码的多肽链中疏水区域大于亲水区域,不含跨膜区及信号肽,不存在于病毒囊膜。     

伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上，下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒，pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了 gD基因的可靠性和完整性，同时构建了测序质粒pSKgDSB,pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序，将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残苦水平上也有差异。     

猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析

根据已发表的PRVgD、gE基因序列 ,设计合成了两对引物 ,对猪伪狂犬病病毒XIN W株相关的毒力基因gD、gE序列进行测定和分析。经PCR扩增分别得到了全长为 12 0 9bp,1 743bp的gD、gE全基因序列 ,将它们克隆到pGEM T Easy载体中 ,并转化JM1 0 9,挑取阳性菌落的质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,与其他参考毒株的gD、gE基因进行比较。结果表明 ,XIN W株与其它毒株相比 ,gD、gE基因核苷酸序列的同源性分别为 97.9%～99.3 % ,98.0 %～ 98.7% ;氨基酸序列的同源性分别为 97.0 %～ 99.3 % ,97.1 %～ 98.1 %。不同的PRV毒株间gD、gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平高度保守。遗传进化树显示 ,XIN W株和国内其它毒株起源相同 ,属同一进化分支     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列，gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆，构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78 ，并采用双脱氧末终止法对全序列进行了分析，发现同国外标准毒株Rice株相比较，在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcNDA3.1 的Kpn1和BamH1位点之间，构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染IBRS-2细胞，经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。     

伪狂犬病病毒上海株的gI基因的克隆和序列分析

参考Genebank发表的伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV)的gI糖蛋白基因序列，自行设计合成一对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，呈现一条约960bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，并进行序列测定，与PRV Rice株gI基因比较发现，核苷酸的同源性为94．7％，氨基酸的同源性为91．3％，证实为gI基因。     

伪狂犬病病毒Min—A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物，对PRVMin—A株进行了PCR扩增，扩增产物克隆于pGEM—TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明，目的片段包含1个1740bp的开放性阅读框(ORF)，编码由579个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明，PRVMin—A株与PRVEa株、SH株PE基因的核菩酸同源性分别为99．2％、98．7％；推导氨基酸的同源性分别为98．6％、97．2％。     

山东省免疫猪场猪伪狂犬病病毒gC基因的序列分析

为了调查山东省使用Bartha-K61疫苗免疫后,猪场猪伪狂犬病(PR)仍旧流行的原因,本研究对山东省动物疫病预防与控制中心在免疫猪场分离到的12株PRV的gC基因进行克隆测序与分析。核苷酸和氨基酸比对结果表明PRV欧美毒株与国内毒株亲缘关系较远,序列具有明显的地域特征,而大部分国内2011年后的分离毒株在氨基酸进化树上位于同一个分支,这表明gC基因的变异具有一定的时间特征。国内毒株gC蛋白的氨基酸与Bartha株的比对结果显示两者在24个位点上存在差异,并且国内毒株在63位之后增加了7个氨基酸AAASTPA。通过对LDZ01-2014毒株与Bratha株的gC蛋白抗原指数、亲水性和表面可及性分析发现两者的差异主要体现在gC蛋白的氨基端1/3部分,以期获得部分山东省Bartha-K61疫苗免疫失败的原因,并为以后的病原学研究和PR的有效防控提供参考。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了1对PCR引物，以伪狂犬病病毒Ea株(pseudorabies virus Ea，PRv Ea)基因组DNA为模板．扩增出一大小为511bp的片段。通过酶切和测序证实，该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因，即gL基因。Blast软件分析表明，该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为94％，氨基酸序列的同源性为95％。将测序结果输入GenBank，获得登录号AF448456。     

伪狂犬病病毒蛋白激酶基因部分序列的克隆和序列测定及转移质粒载体的构建

以伪狂犬病病毒SH株细胞培养物为模板，用PCR方法扩增蛋白激酶(PK)基因部分片段，克隆到pCDNA3中，序列测定显示所扩增的PK基因片段长907bp，与PRVNIA-3株的核苷酸同源性为99．6％。把PK基因克隆到pUCl9上，利用PK基因中间的SalI酶切位点，插入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的基因表达盒，构成了含EGFP的转移载体，为今后研究PK基因的功能和构建PK缺失株奠定了基础。     

猪环曲病毒N基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪环曲病毒(PToV)N蛋白的生物信息学特征,运用RT-PCR技术扩增猪环曲病毒N基因,测序并对其进行生物信息学分析。结果成功获得了492bp的PToV N基因(GenBank登录号为KM036209)。经生物信息学分析,此序列编码163个氨基酸,理论等电点(pI)为12.14,理论分子质量为18 695.5u,不稳定系数为77.47;不同密码子对同一氨基酸选择上呈现一定的偏嗜性;最大疏水指数为1.589,最小疏水指数为-3.533;无信号肽和跨膜区;抗原表位主要位于N末端和C末端。预测其可能包含4个N-糖基化作用位点,2个蛋白激酶C磷酸化作用位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、1个N-豆蔻酰化位点。进化树分析结果显示,KM036209与韩国株和上海株亲缘关系很接近,与荷兰及西班牙株不属于同一分支。     

Second-generation pseudorabies virus vaccine with deletions in thymidine kinase and glycoprotein genes

A modified-live pseudorabies virus (PRV) vaccine, designated PRV(dlg92/d1tk), with deletions in the thymidine kinase (tk) and glycoprotein-gIII (g92) genes, was derived from the PRV (Bucharest [BUK]-d13) vaccine strain. The vaccine virus also contained a deletion in glycoprotein gI. Despite 3 deletions, PRV(dlg92/d1tk) replicated to high titers in cell culture from 30 C to 39.1 C. Enzyme assays and autoradiography revealed that PRV(dlg92/d1tk) did not induce a functional tk activity in infected tk- RAB(BU) cells (rabbit skin). Rabbit skin cells were infected with PRV(dlg92/d1tk), with vaccine strains derived from BUK or Bartha K strains of PRV or with the virulent Illinois (ILL), Indiana-Funkhauser (IND-F), and Aujeszky (Auj) strains of PRV and were labeled with [3H]mannose from 4 or 5 to 24 hours after infection to investigate whether these viruses induced the synthesis of glycoprotein gIII. Nonionic detergent extracts were prepared and immunoprecipitated with antisera from pigs vaccinated with tk(-)-PRV(BUK-d13) or tk+-Bartha K, pigs vaccinated with tk+-PRV(BUK) strains and then challenge exposed to tk+-PRV(IND-F), naturally infected domestic or feral pigs, and pigs vaccinated with tk-)-PRV(dlg92/d1tk). Mouse monoclonal antibodies against PRV glycoproteins gIII, gp50, and gII were also studied. After immunoprecipitation, labeled PRV-specific proteins were analyzed by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography. The PRV glycoprotein-gII complex, but not glycoprotein gIII, was synthesized in PRV(dlg92/d1tk)-infected cells. Glycoprotein gII and gIII were made in cells infected with PRV vaccine strains BUK, Bartha K, and BUK-d13 and with virulent PRV strains ILL, IND-F, and Auj. Cells infected with PRV(dlg92/d1tk) and with PRV strains ILL, IND-F, Auj, Bartha K, BUK, and BUK-d13, excreted into the cell culture medium a highly sulfated glycoprotein gX of about 90 kilodaltons. Antibodies to glycoprotein gIII were not detected in the sera of pigs inoculated with PRV(dlg92/d1tk), but were found in all other swine sera.     

牛ARRDC3和ARRDC4基因的克隆和生物信息学分析

旨在对克隆的牛ARRDC3和ARRDC4基因特性进行分析。以人ARRDC3和ARRDC4基因序列作探针,BLAST获得牛的表达序列标签(ESTs)序列,并设计引物利用RT-PCR方法从牛肩胛骨肌肉克隆c DNA序列,填充牛表达序列标签序列间的空缺,得到牛ARRDC3和ARRDC4基因。序列分析表明,牛ARRDC3基因编码区长1 245 bp,编码414个氨基酸;牛ARRDC4基因编码区长1 242 bp,编码413个氨基酸。氨基酸分析表明,ARRDC3蛋白主要分布在细胞质,不属于分泌蛋白;其磷酸化位点分布于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构预测以无规则卷曲为主;保守结构域预测含一Arrestin_C功能结构域。ARRDC4蛋白主要分布在细胞质和微体,不属于分泌蛋白;其磷酸化位点分布于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构以无规则卷曲为主;保守结构域预测含两段低复杂度序列和一Arrestin_C功能结构域。     

猪博卡病毒VP2基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪博卡病毒VP2蛋白的结构与功能,应用套式PCR技术对猪博卡病毒VP2基因进行分子克隆,并对其进行生物信息学分析。结果显示,获得了1 656bp的猪博卡病毒VP2基因(GenBank登录号为KF806730),此序列与其他PBoV分离株核苷酸序列同源性为82%⁸9%,进化树分析结果显示,KF806730与PBoV5在一个分支,说明两者之间具有较近的亲缘关系。经生物信息学分析,此序列编码551个氨基酸,相对分子质量为61 261.7,理论等电点(PI)为5.98,体外半衰期为30h(体外哺乳动物类网状细胞),不稳定系数为34.36,脂肪系数为54.88,平均亲水性为-0.766,最大疏水指数为1.733,最小疏水指数为-3.378;在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定程度的偏向性;无信号肽和跨膜区;综合多种方法分析预测其主要抗原表位可能位于第78-80aa、311-314aa、507-509aa区域;二级结构、三维结构预测显示VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本试验成功获得猪博卡病毒VP2基因,为以后研究此基因的生物学功能和建立该病毒的诊断方法奠定了基础。     

泡状带绦虫线粒体部分基因克隆及序列比对分析

采集甘肃兰州市区宠物犬体内两株泡状带绦虫,运用分子生物学方法对其线粒体部分基因进行克隆,并使用基因分析软件Larsergene V7.1进行序列分析,结果发现这两株虫体同源性达到99.6%,与国内的泡状带绦虫广东虫株和甘肃虫株同源性分别达到98.7%和98.4%,鉴定为泡状带绦虫;与其他带科绦虫同源性均高于85%,低于88%。其中,与国内牛带绦虫同源性最高,为88%;与国内巨颈带绦虫同源性最低,只有85.1%。推断不同带科绦虫的cox1基因种间差异明显,在带科绦虫的分类上意义较大。     

猪流行伪狂犬病毒gE基因检测及生物信息学分析

为了解当前伪狂犬病毒(PrV)地方流行毒株gE基因的变异特点,根据Guizhou DY株设计引物序列扩增gE基因,并对扩增产物进行序列分析和蛋白特性预测。成功获得1 654bp目的片段,提交GenBank获得登录号KM079613。核酸序列分析在142~144和1 480~1 482位发现2处特征性CGA插入,并导致氨基酸序列在48和494位天冬氨酸插入。相对Ea株编码蛋白O-GlcNAc糖基化位点在563和571位出现偏移,抗原倾向性在420~460位区域明显下降。进化分析显示与2012年以来国内流行毒株WY、ZM、HuXT2012、HBBD、HBLF、XiangA和ZJNB2012同源性较高,达99.8%,而与欧洲、美洲毒株及2012年以前国内毒株同源性较低。表明所感染的伪狂犬病病毒已发生一定的变异,并且gE基因编码蛋白与国内早期分离的Ea株相比在O-GlcNAc糖基化位点和抗原倾向性上也发生了改变。     

A vaccine strain of pseudorabies virus with deletions in the thymidine kinase and glycoprotein X genes

A pseudorabies virus (PRV) mutant with deletions in genes for glycoprotein X (gX) and thymidine kinase, designated delta GX delta TK, was constructed and evaluated as a vaccine for protecting swine against PRV-induced mortality. Doses greater than or equal to 10(3) plaque-forming units (PFU) of this strain given to mice provided protection from challenge exposure with virulent PRV. Sera tested from mice inoculated with delta GX delta TK had high titers of neutralizing antibody to PRV, but reactivity in the same sera was not significantly different from that in sera from noninoculated mice (controls) when sera from both groups were evaluated by use of an ELISA with gX antigen produced in Escherichia coli. Compared with noninoculated pigs (controls), those given delta GX delta TK (greater than or equal to 10(2) PFU) were protected completely from lethal challenge exposure, without experiencing adverse effects on weight gain and with reduction of shedding of virulent challenge virus. Serotest results indicated that, although inoculated pigs responded with strong neutralizing antibody titers, the response of delta GX delta TK-inoculated pigs to gX, as determined by ELISA before challenge exposure, was not significantly greater than the ELISA values obtained from control pigs. The ELISA values from a group of pigs inoculated with a commercially available vaccine were significantly (P less than 0.05) higher than those of control pigs. The experimental vaccine, delta GX delta TK, was avirulent for mice, swine, and sheep, but was mildly virulent for calves (mortality, 1 of 12) and more virulent for dogs (mortality, 3 of 6) and cats (mortality, 2 of 6).(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)