乐果诱导大鼠肝胞凋亡的分析

为研究乐果对大鼠肝细胞凋亡的影响,将24只SD大鼠分成对照组和3个染毒组,分别按体质量以0、1、6和30 mg·kg-1的剂量灌服乐果,连续灌服30 d后,观察肝脏组织学和超微结构变化.同时,通过给大鼠肝细胞培养液中加入乐果(染毒终浓度分别为0、3、10、30、100和300 μmol·L-1),染毒12、24 h后,Annexin V/PI双染法检测肝细胞凋亡率;分别用Fluo-2/AM、双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)和罗丹明123检测细胞内Ca2+浓度、活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△ψm)变化.结果表明,组织学和超微结构检查显示肝细胞脂肪变性、凋亡等.肝细胞染毒12和24 h后,细胞凋亡率明显升高,除3 μmol·L-1组外,与对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01),且呈时间-剂量效应;3μmol·L-1组细胞内Ca2+浓度极显著高于对照组(P<0.01),之后随染毒剂量的增加,细胞内Ca2+浓度逐渐下降;细胞内ROS水平在3～100μmol·L-1范围内随染毒剂量的增大和染毒时间的延长而升高,而在300 μmol·L-1组略有下降,除3μmol·L-1组外,与对照组相比均差异极显著(P<0.01);△ψm除24 h高剂量染毒组(300 μmol·L-1)外均出现持续下降,30～300 μmol·L-1组均小于对照组(P<0.01).本研究表明低剂量乐果染毒可诱导肝细胞发生凋亡,细胞内Ca2+、ROS和△ψm可能参与了这一过程.     

镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的机理及N-乙酰半胱氨酸的保护作用

对神经细胞用不同浓度(0、5、10、20 μmol/L)醋酸镉染毒和N-乙酰半胱氨酸(NAC)(100μmol/L)进行保护,通过流式细胞仪检测了细胞凋亡率、[Ca2+]i和活性氧(ROS)水平.结果表明,与对照组相比,各染毒组细胞凋亡率、细胞内[Ca2+]i和ROS水平明显升高,呈剂量-效应关系,除5 μmol/L组ROS水平外,均差异极显著(P<0.01).添加NAC组与相应染毒组比较,神经细胞凋亡率有降低趋势,但差异不显著(P>0.05);10、20μmol/L组细胞内[Ca2+]i和ROS水平显著降低(P<0.05或P<0.01).表明镉可诱导神经细胞凋亡,其机理可能与细胞内Ca2+和ROS水平升高有关,NAC对其有一定的保护作用.     

乐果对大鼠原代培养肝细胞的毒性试验

通过给大鼠肝细胞培养液中加入乐果(染毒终浓度分别为0,3,30和300μmol/L)染毒,MTT法测定乐果对肝细胞增殖的影响,同时测定肝细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)及细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量,研究了乐果对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用。结果显示,与对照组相比,乐果对原代培养肝细胞增殖有明显的抑制作用,且呈剂量-时间效应关系。染毒后48 h细胞生长达高峰时,细胞活率分别为对照组的97%、82%和75%;300μmol/L染毒组细胞染毒后24 h、36 h、48 h、60 h和72 h细胞活率分别为对照组的67%、82%、75%、71%和63%。同时,乐果染毒12 h和24 h后各染毒组培养液上清中LDH含量均极显著升高(P<0.01),尤其是300μmol/L染毒组12 h和24 h培养液上清中LDH含量分别为对照组的7.35倍和8.75倍;同一剂量组随着染毒时间延长,LDH含量呈上升趋势。染毒12 h和24 h后30μmol/L及300μmol/L组细胞内GSH含量均存在极显著差异(P<0.01);同一剂量组随着染毒时间延长,GSH含量呈下降趋势。表明乐果对肝细胞有直接的毒性作用,能够抑制其增殖,引起细胞膜脂质过氧化损伤。     

钙稳态失衡在镉诱导大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用

用不同浓度醋酸镉（0、5、10、20μmol／L）以及细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM（10μmol／L）单独或联合作用于大鼠大脑皮质神经细胞12h,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞内[Ca2＋];、活性氧（ROS）水平以及线粒体膜电位（△ψm）。结果显示,与对照组相比,各镉染毒组细胞凋亡率、细胞内[Ca2＋]i和ROS水平显著或极显著升高（P〈0．05或P〈0．01）,△ψm显著或极显著降低（P〈0．05或P〈0O．01）。BAPTA-AM联合组与相应镉染毒组相比,细胞凋亡率、细胞内[Ca2＋]i和ROS水平降低,△ψm升高,部分组间差异显著或极显著（P〈0．05或P〈0．01）。结果表明,镉可诱导大脑皮质神经细胞凋亡,细胞内钙稳态失衡在镉诱导大脑皮质神经细胞凋亡中起着重要作用,凋亡机理可能与细胞内钙超栽引起ROS水平升高和△ψm下降有关。     

玉米赤霉烯酮致大鼠睾丸支持细胞氧化损伤及NAC的保护效应

为了揭示玉米赤霉烯酮(ZEA)雄性生殖毒性的机理及建立相应的防控措施,研究ZEA对大鼠原代培养的大鼠睾丸支持细胞(SC)的氧化损伤作用以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对其的保护作用,试验用不同浓度ZEA[0(对照组),5,10,20μmol/L]处理大鼠原代SC 24 h,用试剂盒法检测胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,用流式细胞术检测胞内活性氧(ROS)水平,用JC-1免疫荧光探针结合流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨm)等的变化;添加NAC[设0(对照组)、20μmol/L ZEA、100μmol/L NAC、20μmol/L ZEA+100μmol/L NAC等4组]保护后,检测其对以上指标的影响。结果表明:与对照组比较,10μmol/L ZEA染毒组SOD活性显著升高(P0.05),20μmol/L ZEA染毒组极显著升高(P0.01);10,20μmol/L ZEA染毒组MDA含量均极显著升高(P0.01);5μmol/L ZEA染毒组ROS水平显著升高(P0.05),10,20μmol/L ZEA染毒组ROS水平均极显著升高(P0.01);5μmol/L ZEA染毒组ΔΨm显著下降(P0.05),10,20μmol/L ZEA染毒组ΔΨm均极显著下降(P0.01)。与20μmol/L ZEA染毒组相比,20μmol/L ZEA+100μmol/L NAC联合处理组睾丸支持细胞胞内SOD活性和MDA含量显著下降(P0.05),ROS水平极显著降低(P0.01),ΔΨm极显著增高(P0.01)。说明ZEA可以造成睾丸支持细胞氧化毒性损伤,且一定浓度的NAC对这一过程具有保护作用。     

敌百虫对体外培养大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的影响

为探讨敌百虫对大鼠大脑皮质神经细胞的毒性作用及机理,本研究在建立体外培养新生24h内SD大鼠大脑皮质神经细胞模型的基础上,在细胞培养液中添加0、5、20、80mg/L敌百虫染毒,在染毒后的不同时间测定细胞凋亡率、线粒体膜电位、细胞内[Ca2＋]i、ROS含量和ATP酶的变化。结果显示：①染毒12h,细胞凋亡率明显增加;②染毒12h,各染毒组线粒体膜电位逐渐降低,其中80mg/L组与对照组存在极显著差异（P〈0.01）;③染毒0.5h,各染毒组细胞内[Ca2＋]i显著高于对照组（P〈0.01）;染毒12h,各染毒组细胞内[Ca2＋]i呈下降趋势,但仍显著或极显著高于对照组（P〈0.05或P〈0.01）;④染毒12h和24h,细胞内ROS水平显著或极显著高于对照组（P〈0.05或P〈0.01）;⑤染毒12h,细胞Na＋-K＋-ATPase和Ca2＋-Mg2＋-ATPase活性逐渐降低,20、80mg/L组与对照组有极显著差异（P〈0.01）;上述指标的变化呈显著的剂量-效应关系。结果表明,低质量浓度敌百虫暴露可致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡率和细胞内ROS含量升高,线粒体膜电位下降,细胞内钙离子超载且ATPase活性降低,提示细胞凋亡在敌百虫所致的大脑皮质神经细胞损伤过程中发挥主导作用。     

PERK在玉米赤霉烯酮诱导TM4细胞凋亡中的作用

以TM4细胞(小鼠睾丸支持细胞株)为材料,用不同浓度的玉米赤酶烯酮(zearalenone,ZEA)染毒,利用透射电子显微镜(设0,5,10,20μmol/L ZEA浓度组),流式细胞仪、Western blot等技术检测了细胞超微结构、凋亡率、凋亡相关调控蛋白以及内质网应激相关蛋白的变化(设0,0.1,1,10,20μmol/L ZEA浓度组);通过转染PERK(蛋白激酶R样内质网激酶)siRNA,沉默PERK基因后检测了ZEA诱导TM4细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的变化。结果显示:与对照组相比,20μmol/L浓度组损伤最为严重。随着ZEA浓度的增加,细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的值逐渐升高,cleaved caspase 9、cleaved caspase 3蛋白表达量均呈升高趋势,1μmol/L以上染毒组均较各自对照组有极显著差异(P0.01);内质网应激相关蛋白BIP、CHOP的表达量也呈升高趋势,10μmol/L以上染毒组BIP、0.1μmol/L以上染毒组CHOP的表达量均较对照组有显著或极显著差异(P0.05或P0.01);PERK通路蛋白含量在10μmol/L时最高,20,30μmol/L时逐渐降低,但各染毒组与对照组相比呈显著或极显著差异(P0.05或P0.01);TM4细胞caspase3的活性和凋亡率均呈升高趋势,10μmol/L以上染毒组caspase3的活性较对照组均有极显著差异(P0.01),各染毒组细胞的凋亡率较对照组均有极显著差异(P0.01)。与10μmol/L ZEA处理组相比,siRNA PERK+10μmol/L ZEA组细胞凋亡率呈显著下降(P0.01),Bax/Bcl-2比值、cleaved caspase 3、cleaved caspase 9表达量均下降(P0.05或P0.01)。结果表明,ZEA可触发TM4细胞内质网应激,通过PERK-eLF2α-ATF4信号通路诱导细胞发生凋亡,PERK信号通路在ZEA诱导TM4细胞凋亡中发挥重要作用。     

钙离子超载在镉致大鼠肝细胞凋亡中的作用

拟探讨Ca2+超载在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的作用。采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24 h培养,用醋酸镉、醋酸镉与Bapta-AM共同处理肝细胞。用MTT法检测细胞存活率,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态和凋亡,流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度、ROS生成和ΔΨm变化。结果表明,随着镉剂量的增加和作用时间的延长,细胞变形,坏死细胞和凋亡细胞增多,镉可极显著提高细胞内Ca2+浓度和ROS生成量(P<0.01),极显著降低线粒体膜电位(P<0.01),Bapta-AM可显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低镉的毒性。研究结果提示Ca2+超载在镉致肝细胞凋亡中发挥重要作用。     

玉米赤霉烯酮对小鼠T淋巴细胞活性氧及线粒体膜电位的影响

为揭示霉菌毒素玉米赤霉烯酮(ZEA)免疫抑制作用的机制,试验研究了ZEA对小鼠离体刀豆蛋白(Con A)活化T淋巴细胞内活性氧及线粒体膜电位水平的影响。采用免疫磁珠分选高纯度小鼠T淋巴细胞后,以Con A(5μg/m L)作为T细胞的特异性活化剂,以不同浓度ZEA染毒处理细胞24 h后,设立细胞空白组(只有细胞)、Con A组(细胞+Con A)、20μmol/L ZEA组(细胞+Con A+20μmol/L ZEA)、40μmol/L ZEA组(细胞+Con A+40μmol/L ZEA),利用流式细胞术检测了小鼠T淋巴细胞活性氧及线粒体膜电位的水平。结果:细胞在活化培养24 h后,与阳性对照组相比,空白组细胞的活性氧(ROS)水平很低,ZEA在40μmol/L时,与空白组相比ROS水平显著上升(P0.05)。此外,细胞在活化培养24 h后,与空白组相比,ZEA在40μmol/L时细胞内线粒体膜电位极显著下降(P0.01)。研究表明,玉米赤霉烯酮可以影响小鼠T淋巴细胞的正常氧化还原,进而影响T淋巴细胞的正常功能。     

镉对体外培养大鼠大脑皮质神经元钙稳态的影响

选用原代培养大鼠大脑皮质神经元为模型,用神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元.用不同浓度(0、5、10、20 μmol/L)醋酸镉染毒大鼠大脑皮质神经元12h,利用流式细胞仪检测细胞内[Ca2-]i,ATPase酶试剂盒测定Na-K+ ATPase和Ca2-Mg2--ATPase活性的变化,荧光定量PCR法测定钙调蛋白(CaM) mRNA转录水平.结果表明,免疫组化染色证实培养细胞呈现NSE阳性染色,证明是神经元.与对照组相比,各镉染毒组细胞内[Ca2+]i显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01),Na--K--ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01),20 μmol/L组CaM mRNA转录水平极显著降低(P＜0.01).说明镉可能通过影响CaM的转录水平与维持钙稳态相关的酶(Na+-K-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase)活性,干扰神经元细胞内钙稳态,进而造成神经元细胞损伤.     

镉对大鼠原代肝细胞的毒性损伤

用两步灌流法获得大鼠肝细胞,肝细胞暴露于浓度为2.5、5、10μmol/L的醋酸镉24 h.测定了细胞活力、培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性及细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量的变化.结果表明,细胞相对存活率显著下降(P<0.01),LDH、AST和ALT的释放量增加,5μmol/L和10 μmol/L剂量组与对照组相比差异均显著(P<0.01),细胞内GSH-PX活性降低,各剂量染毒组与对照组相比,差异均极显著(P<0.01);细胞内GSH含量升高,5 μmol/L和10μmol/L剂量组与对照组差异均显著(P<0.05),细胞内MDA含量升高,10μmol/L剂量组与对照组相比差异显著(P<0.05).表明镉可致肝细胞损伤,并且氧化应激起了重要作用.     

镉对体外培养大鼠肾小管上皮细胞的毒性损伤及乙酰半胱氨酸的保护效应

在建立肾小管上皮细胞体外培养模型的基础上,通过在培养液中添加不同浓度的醋酸镉和乙酰半胱氨酸(NAC),用CCK-8法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞内活性氧与线粒体膜电位,探讨了镉对体外培养大鼠肾小管上皮细胞的毒性损伤及NAC的保护效应。结果显示,作用12 h,各染毒组与对照组相比,细胞存活率和线粒体膜电位显著下降(P0.05或P0.01),细胞凋亡率、坏死率、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率和细胞内活性氧含量均显著升高(P0.05或P0.01),呈剂量-效应关系;而NAC保护组与染毒组相比,细胞存活率和细胞凋亡率均有显著差异(P0.05),细胞坏死率无明显差异(P0.05)。结果表明,本试验所选择的镉浓度引起的肾小管上皮细胞死亡是以凋亡为主,氧化应激直接参与镉对肾小管上皮细胞的毒性损伤,NAC对肾小管上皮细胞凋亡有一定的保护效应。     

大豆异黄酮抵抗体外培养猪脂肪细胞氧化损伤的作用

为了探明大豆异黄酮对猪脂肪细胞氧化损伤的保护效应,试验分别用含0、10、20、40μmol/L和80μmol/L异黄酮S(一种合成的大豆异黄酮)或三羟基异黄酮(GEN)的完全培养液培养猪脂肪细胞48h,用终浓度为100μmol/L的FeSO4和H2O2溶液进行氧化处理1 h。结果表明:与正常对照组相比,氧化对照组细胞内活性氧(ROS)水平和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量分别升高了1.61倍和2.74倍(P<0.01);与氧化对照组相比,添加10、20、40μmol/L和80μmol/L异黄酮S使细胞内ROS水平分别下降了24.62%(P<0.05)、20.03%(P<0.05)、37.88%(P<0.01)和41.20%(P<0.01);添加10、20、40μmol/L和80μmol/L GEN均显著降低了细胞内ROS水平(P<0.01)和MDA含量(P<0.05)。试验结果提示在本试验条件下,异黄酮S和GEN能通过抑制猪脂肪细胞的脂质过氧化、降低ROS产生,抵抗羟自由基对猪脂肪细胞的氧化损伤。     

谷氨酰胺及其二肽对过氧化氢诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

本试验通过建立过氧化氢(H2O2)诱导山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡模型,研究谷氨酰胺(Gln)、甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)和丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)对凋亡细胞的凋亡率及Bcl-2、Bax基因表达量的影响。选用60日龄湘东黑山羊的瘤胃上皮传代细胞,采用不同浓度[0(对照组)、100、400、800μmol/L]的H2O2培养细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况。传代瘤胃上皮细胞分为5组,对照组和1组分别添加0、800μmol/L H2O2,2组、3组、4组均添加800μmol/L H2O2,同时分别添加17.28 mmol/L Gly-Gln(2组)、16.0 mmol/L Gln(3组)、16.0 mmol/L AlaGln(4组),应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,同时采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测细胞Bcl-2、Bax基因表达量。结果显示:1)与对照组相比,当H2O2浓度增加到800μmol/L时,早期凋亡的凋亡率显著增加(P0.05),而晚期凋亡的凋亡率随着H2O2浓度的增加呈现增加后减少的趋势,但相对于对照组,都呈显著增加(P0.05)。2)与对照组相比,4组晚期凋亡的凋亡率显著增加(P0.05),试验组早期凋亡的凋亡率均显著增加(P0.05)。3)与对照组相比,试验组Bcl-2/Bax均显著增加(P0.05);与1组相比,2组、3组和4组Bcl-2/Bax均显著增加(P0.05),且2组显著高于3组、4组(P0.05)。综合得出,Gly-Gln对H2O2引起山羊瘤胃上皮细胞早期凋亡具有一定的保护作用。     

没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟的影响

试验旨在研究没食子酸（gallic acid，GA）对黄牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响，进一步优化黄牛卵母细胞体外成熟体系。在卵母细胞体外成熟液（M液）中添加不同浓度没食子酸（0、10、30、50、100 μmol/L），成熟22~24 h后，统计卵丘扩展情况及卵母细胞成熟率；同时，对成熟的卵母细胞进行正常体外受精（IVF），统计早期胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚卵裂球数及卵裂球细胞凋亡率。根据试验结果，选择最优浓度，使卵母细胞在含该浓度没食子酸的成熟液中成熟24 h后，检测其细胞内的活性氧水平（ROS）和总谷胱甘肽（TGSH）含量。结果显示，M液中添加30 μmol/L没食子酸组卵丘扩展分值和成熟率显著高于对照组（0 μmol/L）（P<0.05），其他处理组与对照组无显著差异（P>0.05）；成熟的卵母细胞体外受精后进行后续胚胎培养，其中10和30 μmol/L组的分裂率均显著高于对照组和100 μmol/L组（P<0.05），50和100 μmol/L组分裂率较对照组也有所提高，但差异不显著（P>0.05）；早期囊胚率统计发现，与对照组相比，30和100 μmol/L能够显著提高囊胚发育率（P<0.05），10和50 μmol/L浓度组则无显著差异（P>0.05）；与对照组相比，30、100 μmol/L没食子酸均能显著提高IVF胚胎的早期囊胚卵裂球数（P<0.05）；但囊胚卵裂球凋亡率与对照组无显著差异（P>0.05）；对卵母细胞内活性氧和总谷胱甘肽含量检测时，发现30 μmol/L没食子酸可显著降低细胞内活性氧水平（P<0.05），且显著提高总谷胱甘肽含量（P<0.05）。综上所述，在黄牛卵母细胞体外成熟液中添加适量的没食子酸能有效降低卵母细胞内活性氧水平，提高总谷胱甘肽含量，进而提高卵母细胞成熟的质量及其后续IVF胚胎发育能力。     

甲状腺素对猪小肠上皮细胞miR-let-7a基因表达及细胞增殖的影响

miR-let-7a在动物细胞的分化、增殖与凋亡等方面发挥越来越重要的作用。甲状腺激素(TH)作用非常广泛,机体的每个细胞几乎都是TH作用的靶细胞,其可以促进组织分化、生长和成熟。本实验用甲状腺素(T4)浓度分别为(0、0.02、0.03、0.05、0.075、0.1、0.2μmol/L)在体外培养猪的小肠上皮细胞。结果表明:T4处理组的细胞体积形态相对于空白对照组没有明显变化;当T4添加浓度为0.03μmol/L时,细胞的增殖率显著低于其他组(P0.05);当T4浓度为0~0.03μmol/L时,let-7a的表达随着添加剂量的增加而升高,浓度从0.03~0.2μmol/L变化时,let-7a的表达呈现降低趋势,浓度为0.03μmol/L时表达量极显著高于其他组(P0.01)。let-7a的表达量与细胞增殖呈负相关。     

米托蒽醌通过活性氧诱导大鼠肝癌RH35细胞凋亡的研究

试验旨在探讨米托蒽醌（mitoxantrone,MTN）对大鼠肝癌RH35细胞毒性及其作用机制。以MTT法检测MTN的细胞毒性,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生,Western blotting检测相关蛋白的表达。结果显示,MTN时间和剂量依赖性地抑制RH35细胞的生长;15 μmol/L MTN作用于细胞24、48 h后可使细胞皱缩、变圆,并出芽形成明显的凋亡小体,且其可时间依赖性地诱导凋亡细胞比率的增加及ROS的产生;ROS清除剂NAC可以极显著降低MTN诱导的RH35细胞的ROS的产生和凋亡率（P<0.01）;15 mmol/L NAC可以下调MTN诱导的caspase-3、Bax及CytC表达增加,上调MTN诱导的Bcl-2表达降低。结果提示,MTN通过增加细胞内ROS而诱导RH35细胞发生凋亡。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

【目的】研究乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,为研究体内乙草胺对卵母细胞质量的影响提供参考。【方法】将收集的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)置于含有不同浓度(0(对照组)、10、50、100、130、200 μmol/L)乙草胺的体外成熟培养液中培养14 h,统计卵母细胞第一极体排出率,进行体外受精后,统计体外受精胚胎的囊胚率,筛选出适宜于卵母细胞体外培养的乙草胺浓度。将COCs在对照组和筛选出的适宜浓度的乙草胺组成熟培养液中培养14 h后,利用DCFH-DA检测卵母细胞活性氧(ROS)水平;利用CellTracker^TM蓝色染料检测卵母细胞谷胱甘肽(GSH)水平;利用JC-1染色法检测卵母细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential,MMP);利用实时荧光定量PCR检测卵母细胞内凋亡相关基因的表达水平,利用Hoechst 33342染色检测体外受精胚胎的囊胚细胞总数,用Fluorescein-dUTP染色法检测囊胚细胞凋亡率。【结果】与对照组相比,100、130、200 μmol/L乙草胺组卵母细胞的第一极体排出率显著降低(P＜0.05),100和130 μmol/L乙草胺组体外受精胚胎的囊胚率显著降低(P＜0.05),200 μmol/L乙草胺组体外受精胚胎未发育到囊胚期,因此选择100和130 μmol/L乙草胺进行后续试验。与对照组相比,在100和130 μmol/L乙草胺组中,卵母细胞ROS水平显著升高(P＜0.05),GSH水平及MMP显著降低(P＜0.05),卵母细胞中促凋亡基因Caspase-9的相对表达量显著升高(P＜0.05),而抗凋亡基因Bax、Bcl-2的相对表达量显著降低(P＜0.05);100和130 μmol/L乙草胺组囊胚细胞总数显著降低(P＜0.05),囊胚细胞凋亡率显著升高(P＜ 0.05)。【结论】乙草胺通过提高卵母细胞内ROS及促进卵母细胞凋亡降低卵母细胞的质量,从而影响卵母细胞受精后胚胎的发育潜力。