不同基因型黄瓜果实芳香物质组成及含量差异研究

【目的】研究不同基因型黄瓜果实芳香物质主要组成成分及含量的差异,为黄瓜的品质育种及其栽培提供依据。【方法】以11个不同基因型黄瓜果实为材料,采取固相微萃取结合气相色谱-质谱联用仪(GC-MS),对黄瓜果实的香气物质组成进行分析,并根据其香气值确定黄瓜果实的特征香气成分。【结果】从11个不同基因型黄瓜果实中共检测到78种芳香物质,主要包括醛类、醇类、酮类、烃类及酯类,其中醛类和醇类物质的相对含量最高,分别占芳香物质总量的56.30%～83.95%及7.78%～21.33%,表明醛类和醇类是黄瓜果实芳香物质的主体香气成分;烃类芳香物质1,4-辛二烯在黄瓜中属首次检出。【结论】根据检出芳香物质的香气值,确定(E,Z)-2,6-壬二烯醛、(E)-6-壬烯醛、(E)-2-壬烯醛、己醛、壬醛、(Z)-2-庚烯醛等16种化合物为黄瓜果实的特征香气成分,其中9种特征香气成分为不同基因型黄瓜所共有。     

两个不同类型薄皮甜瓜品种成熟特性、香气成分及其相关酶活性分析

 【目的】比较两个品种薄皮甜瓜成熟特性、主要香气组分和含量以及香气合成相关酶活性。【方法】分别采用气相色谱仪和氧电极法检测薄皮甜瓜果实乙烯释放量及呼吸速率,利用气质联用(GC-MS)检测香气物质的种类和含量并测定香气合成关键酶活性。【结果】‘彩虹7号’乙烯和呼吸跃变期比‘日本甜宝’提前3 d,后者成熟果实可溶性固形物含量显著高于前者;成熟‘日本甜宝’果实中醇类和醛类含量均显著高于‘彩虹7号’,而总芳香物质和酯类含量差异不显著;‘彩虹7号’和‘日本甜宝’中总酯类与乙酸酯类物质含量分别在花后33 d 和35 d达到最大;‘日本甜宝’果皮和果肉中脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)活性显著高于‘彩虹7号’,醇酰基转移酶(alcohol acyltransferase, AAT)活性则正好相反,两品种果实中醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)活性差异不显著,且果皮中芳香物质含量和酶活性均高于果肉。【结论】成熟时‘日本甜宝’中较高的醇、醛含量是其果实清香的重要原因,酯类与各香气成分相互之间构成比例的差异可能是导致薄皮甜瓜果实整体香气不同的原因,LOX、ADH和AAT协同作用影响果实的香气类型。     

‘无籽’瓯柑CsLTP和CsLOX基因的克隆与表达分析

采用同源序列法, 结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术, 克隆获得‘无籽’瓯柑Citrus suavissima ‘Seedless’脂转移酶基因CsLTP和脂氧合酶基因CsLOX的全长cDNA序列; CsLTP cDNA全长667 bp, 1个开放阅读框, 编码215个氨基酸, 与脐橙C. sinensis, 粗柠檬C. jambhiri的脂转移蛋白的相似性分别为95%和60%;CsLOX cDNA全长2 915 bp, 1个开放阅读框, 编码895个氨基酸, 与粗柠檬、美洲黑杨Populus deltoids的相似性分别为99%和51%。荧光定量聚合酶链式反应(PCR)表明:CsLTP和CsLOX的表达量均在‘无籽’瓯柑花粉粒形成期开始显著下降, 并显著低于普通瓯柑Citrus suavissima。‘无籽’瓯柑花粉发育过程中油脂的转运及氧化的异常, 可能成为‘无籽’瓯柑花粉败育的原因之一。     

菠萝蜜果实成熟过程中香气物质形成相关酶的活性变化

[目的]分析菠萝蜜果实成熟过程中香气物质形成相关酶的活性变化,确定对菠萝蜜果实香气物质形成起关键性作用的酶,为菠萝蜜栽培及育种提供理论支撑。[方法]以不同基因型的菠萝蜜为材料,分别以亚油酸钠、氢过氧化亚油酸钠、乙醛和丁醇为底物,测定脂氧合酶( LOX)、氢过氧化物裂解酶( HPL)、醇脱氢酶( ADH)和醇酰基转移酶( AAT)在果实成熟过程中的活性变化。[结果]在果实成熟过程中,LOX在果实成熟早期具有较高活性,在香气物质合成的前期起主要作用;HPL主要参与菠萝蜜果实中醛类香气的形成;ADH活性水平较高;AAT活性变化在种质间存在差异,在果实成熟末期活性增强或略有下降。[结论] AAT是菠萝蜜果实特征香气物质形成的关键酶。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

甜樱桃GalDH、Gal LDH的克隆及在果实发育过程的表达

【目的】探究GalDH和GalLDH在甜樱桃果实AsA生物合成中的作用。【方法】本研究以甜樱桃‘佐藤锦’(Satonishiki)果实为材料,采用改良CTAB法提取总RNA,运用RT-PCR法,克隆并分析了抗坏血酸L-半乳糖合成途径PacGalDH和PacGalLDH基因的cDNA全长序列。此外,采用实时荧光定量PCR分析了两基因在甜樱桃果实发育过程的表达。【结果】获得了1 253 bp长的PacGalDH cDNA序列,其中含有975 bp完整的开放阅读框(ORF),编码324个氨基酸残基。获得了1 914 bp长的PacGalLDH c DNA序列,含有1 791 bp完整的ORF,编码596个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,PacGalDH和PacGalLDH氨基酸序列均与梅和桃对应的氨基酸序列具有较高的同源性,达98%。实时荧光定量PCR分析表明,PacGalDH和PacGalLDH在甜樱桃果实不同发育阶段均有表达,均在花后10 d达到最大表达量,随后逐渐下降。并且,果实总抗坏血酸(T-AsA)含量在花后0 d最高,达44.7 ng/g,此后呈下降趋势。【结论】在果实生长发育过程中,PacGalDH的表达量变化与T-AsA水平变化趋势基本一致,初步推测PacGalDH可能是甜樱桃AsA生物合成的关键酶。     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长DNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR 和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号：HQ444960, CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI＝5.66,分子量MW＝53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop 环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。     

海棠不同品种果实香气物质分析

 【目的】研究不同海棠（Malus sp.）品种果实的香气成分及果实成熟后挥发性物质的变化,为寻找苹果属物种中具有特异香气的种质提供有效的研究方法。【方法】采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用（SPME/GC/ MS）技术,分别测定了‘Red splender’、‘Strawberry parifit’、‘Pink Spire’、‘Radiant’、‘Sparkler’、‘Flame’等6个海棠品种成熟果实的挥发性物质,并对‘Red splender’和‘Strawberry parifit’果实成熟后挥发性物质的变化进行了探讨。【结果】6个海棠品种成熟果实中共检测到37种挥发性物质,主要成分为醛类、酯类和醇类。2-己烯醛是最主要的香气成分,相对含量略有差异,分别占果实挥发性物质总量的45.37%、21.98%、33.56%、32.21%、38.6%和45.88%。果实成熟后,香气组分变化较大。‘Red splender’果实成熟后,2-己烯醛仍为最主要香气成分,含量下降为42.89%,醛类、酯类物质在总组分中所占比例分别减少了12.16%和7.18%,醇类物质在总组分中所占比例增加了13.86%;‘Strawberry parifit’果实中环己醇成为最主要香气成分,含量上升为46.43%,醛类、酯类物质在总组分中所占比例减少了23.74%和9.34%,醇类物质在总组分中所占比例增加了49.03%。【结论】海棠果实的主要挥发性物质为：2-己烯醛、3-己烯醛、己醛、2,4-己二烯醛、苯甲醛、邻苯二甲酸二乙酯。醛类物质是对这些海棠品种果实风味贡献最大的挥发性物质,酯类和醇类是构成不同品种海棠特异香气的重要组成。‘Red splender’、‘Strawberry parifit’果实成熟后,醛类和酯类物质的相对含量下降,而醇类物质的相对含量增加。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

脂氧合酶在香蕉果实成熟过程中的作用

[目的]探讨脂氧合酶(LOX)在香蕉果实成熟过程中的作用.[方法]选取1 000 μ L·L-1丙烯处理采后不同时间(采后10 h和48 h)的香蕉果实,并分析果皮中MaLOX、MaACS和MaACO等基因表达,LOX活性变化,乙烯释放及其与果实成熟的关系.[结果]采后48 h的香蕉果实,经丙烯处理后果皮中LOX活性及...     

黄瓜CsRPL1/2的克隆及其功能分析

【目的】AtRPL是拟南芥果实发育调控网络中的重要基因,参与胎座框的形成。同源克隆黄瓜的RPL,进行表达模式分析,在拟南芥中异源过表达CsRPL,探究CsRPL的生物学功能。【方法】根据拟南芥AtRPL信息在黄瓜基因组数据库中比对,克隆得到黄瓜CsRPL;利用MEGA5.2对CsRPL与其他物种同源蛋白进行氨基酸序列比对;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及原位杂交技术检测CsRPL在黄瓜中的表达模式;在拟南芥中异源表达CsRPL,并对转基因植株进行表达和表型分析。【结果】在黄瓜中存在两个RPL,分别命名为CsRPL1和CsRPL2,均含有BELL-Domain、Homeodomain保守域和两个EAR-Motif。CsRPL1在黄瓜各个部位均有表达,在开放的雄花中表达量最高,且在果实生长前期,其表达量随着果实的发育逐渐降低;CsRPL2在黄瓜各部位表达量均显著低于CsRPL1。原位杂交显示CsRPL1/2在黄瓜果实的胎座框中表达,且杂交信号在茎尖分生组织（SAM）的Central zone（CZ）区域富集。拟南芥异源过表达CsRPL1/2转基因植株的果荚变短,花粉育性降低,且种子发育受到抑制。【结论】CsRPL1/2参与生殖器官的发育,且可能存在功能冗余,在正常生长条件下,CsRPL1优先发挥功能。相比于AtRPL,CsRPL1/2的功能并不完全保守。     

黄瓜CSHSP70基因内含子结构分析

 【目的】探明黄瓜CSHSP70基因的内含子数目及其结构特点。【方法】根据黄瓜CSHSP70基因cDNA序列设计引物，应用PCR技术从gDNA中克隆CSHSP70基因，采用RT-PCR技术验证内含子的存在。【结果】经测序与拼接，得到长度为4 056 bp的黄瓜CSHSP70基因，它包含7个内含子。经分析发现这些内含子富含A•T，具有类似启动子和HSE核心结构的序列存在。对黄瓜、甜瓜和丝瓜CSHSP70基因部分序列的比较分析表明，该基因在这3个葫芦科作物中具有很强的保守性。【结论】内含子存在的特殊结构表明其可能对该基因表达具有调控作用。     

黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)的克隆及其在低氮条件下的表达

【目的】分离和克隆黄瓜谷氨酰胺合成酶GS1基因,分析其序列特征,了解其在低氮条件下的表达情况。【方法】依据黄瓜基因组数据库中Csa015274基因编码区全序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,从黄瓜叶片cDNA中克隆该基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析鉴定,并用实时荧光定量PCR法研究GS1基因在不同氮素浓度下的表达变化。【结果】分离到GS1基因,GenBank登录号为JQ277263。该基因长1 071 bp,编码356个氨基酸,与甜瓜(Cucumis melo L.)GS1基因同源性高达97%。该基因编码的蛋白是1个不稳定的疏水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点等活性位点。GS1基因表达模式分析显示,在低氮条件下,该基因下调表达,随着氮素浓度的增高GS1基因的表达量增加。在高浓度的氮素水平下,该基因的表达同样受到抑制。【结论】成功从黄瓜叶片中分离克隆到GS1基因,该基因具有已知物种GS1基因的特征,可用于该基因的功能研究。     

苹果果实发育及成熟软化过程中LOX的活性特点

研究了脂氧合酶(LOX)在富士苹果果实不同发育时期及采后乙烯调控下的活性变化。结果表明,LOX活性在果实生长发育阶段呈"V"字型变化,在盛花后1月及采收时表现出较高的活性,说明LOX不仅与果实成熟衰老有关,还极有可能在果实的细胞分裂和膨大过程中起重要作用;采后经1-甲基环丙烯(乙烯抑制剂)处理的果实,其LOX活性明显受到抑制;乙烯利处理则促进了LOX活性。相关性分析表明,1-甲基环丙烯、乙烯利、对照果实的LOX活性均与乙烯释放速率呈极显著(P0.01)正相关,即LOX活性受乙烯调控,参与果实成熟软化。     

榅桲果实CAD基因的克隆、序列分析及表达

【目的】研究榅桲果实木质化与CAD基因的关系。【方法】基于GenBank报道的近缘物种CAD基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0 软件设计PCR 扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR 方法成功扩增出CAD 基因片段并克隆到pMD18-T 载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。通过间苯二酚染色鉴定果肉发育时期木质素的积累程度,并利用RT-qPCR对CAD基因在发育期时期的表达规律进行检测。【结果】榅桲CAD基因其开放阅读框(ORF)序列为1 071 bp,编码356个氨基酸,与其他物种序列同源性最高达96%,进化关系上与苹果较近。在果实6个发育时期,木质素积累逐渐降低,而CAD基因表达与果实木质化程度紧密相关,随着木质素合成趋缓呈现一个逐步下调的趋势。【结论】CAD基因是调控榅桲果实木质化的关键基因。     

小麦Antiquitin cDNA克隆、空间结构预测及表达谱分析

 【目的】从普通小麦中克隆Antiquitin（TaATQ）cDNA,分析其编码序列及空间结构特征,研究其在不同组织、种子发育过程及干旱和盐胁迫下的表达谱。【方法】基于EST拼接,通过RT-PCR方法克隆小麦TaATQ cDNA;通过同源建模分析TaATQ的结构特征,通过实时定量PCR研究其在不同组织和胁迫条件下的表达谱。【结果】克隆到小麦TaATQ cDNA序列1 530 bp,编码54 kD目标蛋白。TaATQ属于醛脱氢酶超家族第7家族（ALDH7）,与水稻、豌豆、人、小鼠、线虫、果蝇等物种ATQ序列相似性依次为91.7%、78.1%、58.3%、58.9%、58.1%和52.5%。细胞中,功能性TaATQ可能以四聚体形式存在,每个单体由NAD＋结合结构域、催化结构域、寡聚化结构域3部分构成。盐胁迫条件下叶和根中TaATQ的表达均显著升高;干旱胁迫条件下,叶中TaATQ表达显著上升,而根中TaATQ表达变化不显著。【结论】TaATQ具备醛脱氢酶家族蛋白典型结构特征,在小麦抗逆过程中起重要作用,可作为提高作物抗旱耐盐的靶基因应用于作物遗传改良。