编码棉铃虫化学感受蛋白cDNA的克隆及序列分析

 从棉铃虫触角中克隆了一条全长722bp的cDNA序列，命名为CSPHarm。CSPHarm阅读框全长381bp，编码127个氨基酸残基，推导的氨基酸序列具有昆虫化学感受蛋白的典型特征。CSPHarm与已报道的其它昆虫的化学感受蛋白的氨基酸序列有很高的同源性，因此，CSPHarm是一个编码棉铃虫化学感受蛋白的基因。CSPHarm具有强烈的亲水性，但是在第20～30位的氨基酸组成一个亲脂性的结构，这可能是结合亲脂性气味物质的区域。半定量RT-PCR研究结果显示，CSPHarm在棉铃虫头、胸、腹、足、翅和触角等组织中表达量都很高，在不同组织中的表达量没有明显的区别，在卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达，在卵中表达量相对较低，在成虫体内表达量较高。     

华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析

 【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。     

油茶14-3-3蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

以构建的油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子克隆技术,分离克隆1个14-3-3蛋白的全长cDNA序列,由1 156个核苷酸组成,5'非编码区57 bp,3'非编码区301 bp,开放阅读框长777 bp,编码259个氨基酸.该基因编码蛋白的分子质量为29.466 ku,等电点4.78,无信号肽序列,是非分泌蛋白,命名为Co-14-3-3a.推测的二级结构有9个α-螺旋,1个反平行的β-折叠,位于αC和αD之间.     

灰飞虱β3-微管蛋白cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱RNA，利用RT—PCR技术，克隆了灰飞虱体内β3-微管蛋白基因部分序列。进一步通过3’-和5’-RACE获得了全长。序列分析表明，该基因(LSTUB3)长1859bp，编码的蛋白含454个氨基酸，分子量约为51kDa；类似于其他昆虫的β-微管蛋白，LSTUB3含有2个氨基酸保守区：NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF。另外，LSTUB3还具有1个由6个氨基酸组成的β3-微管蛋白特征性的插入序列：CASRGG。结合已发表的其他昆虫该基因的序列，构建了分子系统树，系统分析表明：LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性，达85．7％以上。     

灰飞虱β3-微管蛋白 cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱 RNA,利用 RT- PCR技术,克隆了灰飞虱体内β 3-微管蛋白基因部分序列.进一步通过 3'- 和 5'- RACE获得了全长.序列分析表明,该基因 (LSTUB3) 长 1 859 bp,编码的蛋白含 454个氨基酸,分子量约为 51 kDa;类似于其他昆虫的β-微管蛋白, LSTUB3含有 2个氨基酸保守区 NNWAKGHY和 RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF.另外, LSTUB3还具有 1个由 6个氨基酸组成的β 3-微管蛋白特征性的插入序列 CASRGG.结合已发表的其他昆虫该基因的序列,构建了分子系统树,系统分析表明 LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性,达 85.7%以上.     

棉铃虫Gq蛋白α亚基基因的克隆及组织特异性表达

 【目的】了解棉铃虫体内Gqα的组织特异性表达情况。【方法】利用RACE技术获得了Gqα全长基因，利用半定量RT-PCR研究了该基因的时空表达情况。【结果】从棉铃虫Helicoverpa armigera触角中克隆了一条全长1 101bp的Gqα cDNA序列，命名为GqαHarm；阅读框全长1 062 bp，编码353个氨基酸残基。GqαHarm与已报道的昆虫Gq蛋白α亚基同源性在90％以上，与近缘种甘蓝夜蛾Mamestra brassicae Gqα的同源性高达96.88％，与家蚕Bombyx mori Gqα的同源性高达97.73％。半定量RT-PCR研究表明，GqαHarm在棉铃虫雌雄成虫触角中表达，在头、胸、腹、足和翅中也有表达，并且表达量差异不显著；此外，在喙、下颚须和下唇须中也有表达；在卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达；在卵中的表达量最高，而在成虫中的表达量最低，在幼虫和蛹的前、中、后期的表达量差异不大。【结论】研究表明GqαHarm是一种在棉铃虫体内普遍存在的蛋白。     

紫草LeEXT-1基因的克隆、序列及表达分析

以硬紫草细胞为材料,采用快速扩增cDNA末端法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了由抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和cDNA芯片技术筛选获得的在黑暗条件下优先表达的LeEXT-1基因的全长cD-NA。生物信息学分析结果表明,该cDNA全长为1 077 bp,编码1个含247个氨基酸的蛋白,与编码伸展蛋白(extensin)的基因具有高度的同源性。基因表达分析结果表明,当紫草细胞从B5培养基转到M9培养基时,LeEXT-1基因在2 h内被快速诱导表达,随后又逐渐降低到一个较低的水平。该基因的克隆为进一步研究伸展蛋白在紫草宁合成调控中的作用奠定了基础。     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

橘小实蝇α1微管蛋白基因的克隆和表达分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得橘小实蝇α1微管蛋白基因的cDNA全长序列,命名为α1-Bdortub。测序结果表明,α1-Bdortub开放阅读框全长1 353 bp,编码450个氨基酸残基。氨基酸序列比对表明,α1-Bdortub与黑腹果蝇α1-tubulin的氨基酸序列相似性最高,为99.8%。不同部位和不同时期的实时荧光定量PCR分析表明,α1-Bdortub在不同部位都有表达,雌虫翅中的表达是其生殖节中的12倍。从幼虫期到蛹期α1-Bdortub mRNA表达量逐渐提高;第1、2、3天幼虫中的含量分别为第10天蛹的0.71、1.16、4.01倍;在第1、4、7天蛹中的含量分别为第10天蛹的4.22、13.2、18.5倍。结果提示,α1-Bdortub可能与橘小实蝇的发育有关。     

梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-1和HaFT-2克隆及表达分析

根据前期梭梭干旱转录组测序得到的Unigene序列,成功克隆2个梭梭14-3-3蛋白基因,分别命名为HaFT-1和HaFT-2,并对其进行基因表达分析。结果表明:HaFT-1基因在梭梭的根、种子中均可表达,且根中表达最强;HaFT-2基因在梭梭同化枝中表达最强,根的表达量次之。干旱胁迫后HaFT-1和HaFT-2基因的表达量均下调。本研究初步分析HaFT-1、HaFT-2基因的表达模式,为进一步研究该基因功能奠定基础。     

棉铃虫鞣化激素基因克隆及分子特性分析

【目的】获得棉铃虫鞣化激素2个亚基(α亚基和β亚基)基因序列,分析其分子特性和表达模式,研究棉铃虫鞣化激素的作用机制奠定基础。【方法】通过生物信息学和分子生物学技术分别得到棉铃虫鞣化激素α和β亚基cDNA序列,将棉铃虫及NCBI中公布的已知其它昆虫鞣化激素α和β亚基氨基酸序列分别整理分析,利用MEGA7(7.0.14)软件的Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型构建系统进化树并进行聚类分析,qRT-PCR分别检测两亚基在棉铃虫不同生长发育阶段的表达模式。【结果】分别获得了棉铃虫鞣化激素 α亚基与β亚基核苷酸序列。其中α亚基(GenBank登录号:AHM0247472.1)cDNA片段长694 bp,开放阅读框480 bp,编码159个氨基酸残基,预测该蛋白质分子量为17.7 kDa。该基因在卵期第3 d、1龄幼虫第1 d、3~5龄幼虫第1 d、2和3龄末蜕皮期(3M和4M)、蛹期第0 d、第3 d和第7 d表达量相对较高。β亚基(GenBank登录号:AHM0247473.1)cDNA片段长779 bp,开放阅读框420 bp,编码139个氨基酸残基,预测该蛋白质分子量为15.9 kDa。该基因在卵期至2龄末蜕皮期(3M)、3龄幼虫第2 d、4~5龄幼虫第1 d、蛹期第1 d至羽化前表达量相对较高。鞣化激素α亚基和β亚基基因均在棉铃虫胸神经节中相对表达量最高,咽下神经节次之,脑部和腹部相对表达量较弱。【结论】鞣化激素在鳞翅目昆虫中具有较高的保守性;α亚基和β亚基基因主要在棉铃虫卵期、初孵幼虫期、蛹期和新羽化成虫期发挥作用;鞣化激素在棉铃虫幼虫体内主要由胸部神经节转录合成。     

棉铃虫中肠氨基氨肽酶N基因的克隆及序列分析

 通过简并引物PCR结合RACE技术 ,从棉铃虫中肠中克隆了 1个氨基氨肽酶N基因 ,该基因全长 30 4 3bp ,阅读框包括 2 85 6bp ,编码 95 1个氨基酸。预测蛋白分子量为 10 8.3kD ,等电点为 5 .2 9。序列中具有谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN以及锌结合位点HEXXHX18E。N 末端 2 0个氨基酸具有信号肽的特征 ,C 末端 2 5个氨基酸具有明显的亲脂性 ,并且具有跨膜特征。该基因已经在GenBank中登记 ,序列号为 :AY1810 2 6。     

Cloning and Sequencing of a Gene Encoding Aminopeptidase N in the Midgut of Helicoverpa armigera (Hübner)

A cDNA encoding aminopeptidase N was cloned by degenerated PCR combined with RACEtechnique in this paper. The full-length of APN-Harm is 3 043 bp. Open reading frame is 2 856 bp inlength, encoding 951 amino acid residues. Its predicted molecular weight and isoelectric point are 108.3kDa and 5.29, respectively. This deduced amino acid sequence shares some common structural features withaminopeptidase N from several moth species, including the consensus zinc-binding motif HEXXHX18 E and the GAMEN motif common to gluzincin aminopeptidases. The first 20 amino acid residues at N-termini ishydrophobic transmembrane helix. The sequence of APN-Harm was deposited in GenBank and the accessionnumber is AY181026.     

Cry1Ac抗、感棉铃虫碱性磷酸酯酶（ALP1）的表达量比较

【目的】通过比较Cry1Ac抗、感棉铃虫昆虫中肠碱性磷酸酶（ALP1）表达量的差异及抗性棉铃虫取食Cry1Ac蛋白对ALP1表达量的影响,分析ALP1表达量变化与抗性的关系,为进一步明确Bt抗性机制、制定抗性治理策略提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR技术,比较敏感棉铃虫、Cry1Ac抗性棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料和正常饲料后ALP1表达量的差异。【结果】ALP1在棉铃虫整个发育期都表达,幼虫的表达量最高,蛹期表达量最低,在成虫体内也有较高的表达;ALP1在幼虫中肠表达量最高,其次是后肠、前肠、马氏管,表皮中的表达量最低;与敏感品系相比,对Cry1Ac具有中等水平抗性的棉铃虫ALP1表达量明显增加,尤其是取食含Cry1Ac蛋白饲料的抗性棉铃虫幼虫的ALP1的表达量显著升高,但抗性棉铃虫取食正常饲料后,2、3龄幼虫的ALP1的表达量与敏感棉铃虫差异不显著;所有的抗性品系4龄棉铃虫幼虫中肠ALP1的表达量都显著高于敏感品系,而且随着棉铃虫抗性倍数的升高,ALP1的表达量呈逐渐降低的趋势。【结论】抗性棉铃虫中肠ALP1表达量的改变可能与Cry1Ac抗性、Cry1Ac代谢有一定的关系。     

对久效磷抗性棉铃虫品系的选育及其乙酰胆碱酯酶的研究

用久效磷对采集于山东聊城抗性地区的棉铃虫Helicoverpa armigera (Huebner)进行抗性品系选育，经过10代的室内选育，抗性倍数达211．88倍，为选育前的6．67倍，发现筛选后对氰戊菊酯，氯氰菊酯和灭多威的抗生分别下降了8．13，7．44和13．36倍，对甲基对硫磷和辛硫酸的抗性基本保持不变，这说明久效磷与其他5种被试药剂之间没有明显的交互抗性，还对抗，感棉铃虫体内AChE进行了研究，对久效磷抑制粗酶液的实验表明，抗性品系锦铃虫体内AChE的交互抗笥，还原抗，感棉铃虫体内AChE进行研究，对久效磷抑制粗酶液的实验表明，抗性品系棉铃虫体内AChE的I50是敏感品系的3．18倍，酶液纯化使抗，感品系AChE的I50分别下降6．69和3．49倍，说明粗提液中存在AChE保护因子，且这种保护因子在抗性品系中更有效，但纯化后，抗，感品系的AChE敏感性之间仍存在1．66倍的差异，此外，两品系AChE的动力学参数也存在显差异，由此认为AChE敏感性降低与其它因子共同组成了棉铃虫对久效磷的抗性机制。     

Characterization and functional analysis of β-1,3-galactosyltransferase involved in Cry1Ac resistance from Helicoverpa armigera(Hübner)

Carbohydrate chains are the principal antigens by which Bacillus thuringiensis(Bt) identify receptor proteins. The interaction between the antigen and Bt causes a pore in the membrane of midgut epithelial cells of insects. Receptor proteins, such as aminopeptidase N and alkaline phosphatase, are glycoproteins. Cadherin is another cell surface receptor protein which has potential glycosylation sites. Glycosyltransferase is very important for the synthesis and modification of receptor proteins. It can indirectly influence the function of Bt. The 1 950 bp full-length c DNA encoding β-1,3-galactosyltransferase was cloned from the the midgut of Helicoverpa armigera by degenerative PCR combined with RACE techniques(GAL-Harm, Gen Bank accession no.: GQ904195.1) with two potential N-glycosylation sites(157NNTI160 and 272NKTL275). Protein sequence alignments revealed that H. armigera β-1,3-galactosyltransferase shared high identity with β-1,3-galactosyltransferase in other insect species. The expression level of the β-1,3-galactosyltransferase gene in Cry1Ac-resistant H. armigera larvae was 9.2-fold higher than that in susceptible strain. The function of β-1,3-galactosyltransferase was investigated using RNAi technique. The result showed Cry1 Ac enhanced the toxicity against the si RNA-treated larvae compared with non-si RNA-treated ones, which indicated β-1,3-galactosyltransferase played an important role for the insecticidal toxicity of Cry1 Ac in H. armigera.     

棉铃虫多核衣壳型多角体病毒fp25K基因的克隆及分析

[目的]克隆棉铃虫多核衣壳型多角体病毒(HearMNPV) fp25 K基因,为深入研究杆状病毒的进化机制提供依据。[方法]通过半补齐法建立HearMNPV的质粒基因组文库,对插入片段进行鉴定和序列分析获取HearMNPV fp25 K基因。[结果]HearMNPV fp25 K基因的读码框由588个核苷酸组成,编码195个氨基酸;该基因上游具有晚期调控保守序列ATAAG,是一个晚期表达基因;HearMNPV fp25 K存在5个α-螺旋,8个β-折叠;HearMNPV与蓓带夜蛾核型多角体一致性最高,达97.0%,与舞毒蛾多核衣壳型多角体的FP’同源性最低,仅为19.3%。HearMNPV与GroupⅠNPVs、GroupⅡNPVs及GVs的fp25K同源基因间氨基酸平均相似性分别为55.6%、69.4%和29.3%,推测其与Ⅱ类NPVs的亲缘关系较近。[结论]该研究为杆状病毒分子进化、生物防治奠定了基础。