草鱼脂肪酸结合蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

    根据GenBank上已发表的其他物种的脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein, FABP)基因序列设计1对引物,从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)cDNA文库中扩增出脂肪酸结合蛋白基因,定向克隆于表达质粒载体pET32A中构建成pET32A-FABP重组体,将重组体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,以终浓度1 mmol·L-1的IPTG对其进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析表明,与阴性对照相比,阳性克隆在分子量33 kDa处有1条明显的蛋白带,大小与预期结果一致.经光密度分析可知,目的蛋白约占总可溶性蛋白的49.5%.这为进一步研究脂肪酸结合蛋白生物学特性以及FABP基因对脂肪代谢调控规律奠定了基础.     

新城疫病毒HN基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT—PCR方法扩增新城疫病毒HN基因并将其克隆至T载体,测定其核苷酸序列。尔后用PCR扩增球状头部编码区,并将其克隆至pSOC质粒soc基因3端EcoR Ⅰ位点,重组质粒pSOC—HN转化E．coli BL-21(DE3)感受态细胞。以终浓度1mmol／L的IPTG诱导表达,在SDS—PAGE凝胶上可检测到分子量约67KD的融合蛋白特异条带,west—blot证实表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性。     

新城疫病毒HN基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法扩增新城疫病毒HN基因并将其克隆至T载体,测定其核苷酸序列.尔后用PCR扩增球状头部编码区,并将其克隆至pSOC质粒soc基因3端EcoR Ⅰ位点,重组质粒pSOC-HN转化E.coli BL-21(DE 3)感受态细胞,以终浓度1 mmol/L的IPTG诱导表达,在SDS-PAGE凝胶上可检测到分子量约67 KD的融合蛋白特异条带,west-blot证实表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性.     

奶牛γ-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达

根据奶牛γ干扰素 ( Bov IFN-γ)基因的 c DNA序列设计 1对引物 ,应用一步法逆转录聚合酶链式反应 ( RT-PCR)技术从奶牛脾淋巴细胞的总 RNA中扩增出特异性片段。将 RT-PCR产物克隆到 Pucm-T载体中 ,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的 Bov IFN-γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体 PGEX-6P-1谷光甘肽 S 转移酶基因的下游 ,经 IPTG诱导后 ,表达出 42 ku的融合蛋白 ,薄层扫描测定可溶性融合蛋白表达量约占菌体可溶性总蛋白的 2 5 %。通过细胞病变抑制试验证实 ,融合蛋白具有较好的生物学活性 ,在牛肾细胞上抑制水泡性口炎病毒的活性可达到 1 63 84U· mg- 1 ,有望成为预防和控制奶牛疾病的新产品。     

生物信息学在新基因克隆中的应用

随着计算机科学、物理学、数学等与生命科学的相互渗透交叉;生物信息学愈来愈显示出其重要性。这其中计算机科学尤其是网络技术的广泛应用,使得世界各国的生物学研究者所获得的数据、成果能够共享。数据库的建立、软件的开发及各种服务工具的发展让研究者了解和使用共享信息。     

鸭leptin基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析

 【目的】研究鸭leptin在体外高效表达特点，探讨表达产物的生物学活性及其功能。【方法】构建重组鸭leptin基因原核表达菌株，重组菌株经不同浓度IPTG和不同时间诱导后，对表达蛋白进行提取、纯化、复性和浓缩，经注射昆明小鼠后，对小鼠的体重﹑采食量和体脂含量进行分析。【结果】鸭leptin在大肠杆菌中实现了高效特异性融合表达，融合蛋白分子量约为20 kD，其中16 kD为鸭leptin基因表达产物，目的蛋白在0.2 mmol•L-1 IPTG的诱导下，表达量最高约占菌体总蛋白的57%。重组蛋白纯化﹑复性﹑浓缩后，能够明显降低小鼠摄食量、体重和体脂含量。【结论】鸭leptin基因在大肠杆菌中进行了高效融合表达，表达产物具有明显的生物学活性。     

鸭疫里默氏杆菌感染后雏鸭血清生化指标变化的研究

[目的]为鸭疫里默氏杆菌病的临床诊断和防治提供依据。[方法]对人工感染Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌的20日龄天府肉雏鸭的葡萄糖(GLU)、胆固醇(TC)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、淀粉酶(AMS)6个血清生化指标的动态变化进行测定。[结果]感染Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌1 d后,少数雏鸭开始出现明显症状,感染3 d后大部分感染雏鸭开始发病。感染后3 d为发病死亡的高峰期,而感染7 d后未见新的发病鸭只,耐过鸭开始进食,与病情发展相一致。感染鸭疫里默氏杆菌后雏鸭6个血清生化指标均有变化,GLU、TC、LDH和ALT在感染后第3天均明显升高,在感染后期逐渐回落接近正常值。[结论]鸭疫里默氏杆菌感染属急性感染。     

香蕉果实乙烯受体基因克隆及其表达特性

 【目的】分析香蕉果实成熟及贮藏冷害下乙烯受体基因的表达特性,探讨热处理（38℃,3 d）提高果实耐冷性与乙烯受体基因表达的关系。【方法】根据已报道的ETR基因的氨基酸保守序列设计引物,以香蕉果皮总RNA为模板,利用RT-PCR方法克隆香蕉的ETR cDNA,采用Northern杂交分析该基因的表达特征。【结果】香蕉果实在自然成熟进程中,两个基因在果皮和果肉中呈现不同的表达模式：果皮和果肉中Ma-ETR1的表达随果实成熟而逐渐减弱,而Ma-ERS3的表达仅在果实成熟后期略有增强;外源丙烯处理和38℃高温抑制果皮和果肉中Ma-ETR1的表达,却促进了Ma-ERS3的表达;低温促进果皮中Ma-ETR1和果肉中Ma-ERS3的表达,而38℃热处理3 d后则能抑制果皮中受低温诱导的Ma-ETR1表达的增强。【结论】外源丙烯和38℃高温正调控Ma-ERS3表达,负调控Ma-ETR1表达;38℃热处理3 d提高采后香蕉果实耐冷性与抑制低温诱导的果皮中Ma-ETR1表达的增强有关。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶一聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果。从杭州市郊区感病的油菜上分离到一致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１３退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－Ｃ     

天香百合、药百合黄酮醇合成酶FLS基因克隆和表达分析

以天香百合(Lilium auratum)和药百合(L.speciosum var.gloriosoides)为研究材料,分别克隆获得黄酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)基因,命名为LaFLS和LsFLS。实验结果表明,LaFLS和LsFLS基因均含完整的开放阅读框1 035 bp,均编码344个氨基酸,氨基酸序列高度保守,均具有DIOX-N结构域和2-酮戊二酸和铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶结构域,属于2-酮戊二酸和铁(Ⅱ)依赖性双加氧酶超家族;系统进化分析表明,LaFLS和LsFLS除与东方系百合西伯利亚和索邦的FLS亲缘关系最近外,与百合科郁金香(Tulipa fosteriana)等亲缘关系较近;生物信息学分析显示,LaFLS和LsFLS蛋白无信号肽序列和跨膜结构域,均为亲水性蛋白,亚细胞定位结果显示二者主要定位在细胞质中。基因表达分析结果表明,在花蕾发育过程中,LaFLS和LsFLS随花蕾发育出现先上升后下降再上升的趋势,而且在花被片无色区的表达量显著高于有色区域。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。     

鸭维甲酸诱导基因I克隆及其结构域功能分析

【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）,分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS（coding sequence）区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体（RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C）,转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达变化。【结果】鸭RIG-I基因CDS区全长2 802 bp,共编码933个氨基酸;不同结构域缺失突变体的真核表载体转染DF1细胞后,重组蛋白均在DF1细胞中表达;RT-qPCR结果显示,N端能显著激活RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达上调。【结论】 duRIG-I及不同区段均能在DF1细胞中表达,其中N端在调节RLR抗病毒信号通路下游基因的表达过程中发挥了重要作用。     

Molecular Cloning of Myostatin Partial cDNA of Beijing Duck and Its Expression in Breast Muscle

In this experiment, 500 bp cDNA of myostatin gene was cloned from a Beijing duck＇s breast, The duck myostatin gene was found to have 98, 96, 95, 88, and 87% sequence similarity at the cDNA level with domestic goose, chicken, domestic pigeon, human, and pig, respectively. The predicted amino acid sequence has an overall similarity with a comparable region of turkey 99%, domestic goose 98%, and chicken 99%. Conserved domains of deduced amino acids showed that it belonged to the TGF-beta family. Myostatin expression in breast muscle was higher at 28, 35, and 42 days than at 7, 14, and 21 days. The pattern of myostatin expression was closely parallel to the trend of breast muscle growth, suggesting that myostatin might play an important role in breast muscle development. It was possible to postulate that myostatin may be a major determinant of muscle mass in breast muscle, as shown in other species.     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

鸭Rab6基因cDNA的克隆及组织特异性表达

【目的】研究鸭Rab6基因序列并进行序列分析,揭示该基因的组织特异性表达规律。【方法】运用RT-PCR技术获得鸭Rab6基因序列,并用半定量RT-PCR方法研究该基因的组织特异性表达规律。【结果】从35周龄母鸭脂肪组织中克隆了Rab6基因的cDNA序列,大小为761 bp,包含1个627 bp完整开放阅读框,编码208个氨基酸。该序列与小鼠、狗、人等物种的Rab6有86.1%～93.1%的同源性,而相应蛋白的同源性达97.6%以上。蛋白预测的分子量为23 534 D,等电点预测为5.42,该蛋白在78～102氨基酸处有1个跨膜结构,这些特征与人、小鼠、狗等物种高度相似。半定量RT-PCR研究结果显示,Rab6基因在所测组织中均表达,在小肠、肝、脾、间脑、肾、脂肪组织中高度表达,腺胃、骨骼肌、肌胃组织中中度表达,心、肺、卵巢中低度表达。【结论】Rab6基因在动物进化中具有高度保守性,具有相似的生物学功能,该基因的表达具有组织特异性。     

中华蜜蜂NPC2基因家族克隆及表达模式分析

【背景】 作为我国本土重要的资源昆虫,中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值,其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现,与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】 以中蜂NPC2家族基因为研究对象,克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异,为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】 基于中蜂高、低温转录组测序结果,利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列,进行系统进化树分析和三维结构预测,然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱,以及高、低温时的表达量变化。【结果】 获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长,分别为447、480、459和465 bp,编码148、159、152和154个氨基酸,预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD,等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近,与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示,AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高,其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期;AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高,在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达;AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达;AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后,4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升,但差异不显著。【结论】 AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构,其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性,其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达,表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升,表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性,或与初冬季访花行为有关。     

半番鸭和北京鸭MC1R基因的克隆与序列分析

羽色是半番鸭一个重要的经济性状.黑素皮质素受体1(melanocortin receptor 1,MClR)基因是控制动物黑色素合成的重要基因.根据鸡、鹌鹑、雪雁、孔雀等MC1R基因同源序列的保守区设计1对引物,以半番鸭、北京鸭总DNA为模板,PCR扩增,克隆测序.结果,获得了2个长度为900bp的基因片段,并提交GenBank,登录号分别为EU877265和EU877264.经比对,发现北京鸭与半番鸭核苷酸序列存在8个变异位点,其中位于184bp(T/A)、229bp(G/A)、364bp(A/G)、385bp(G/A)处的变异导致了氨基酸序列分别在第62位(c/s)、77位(E/K)、122位(T/A)和129位(v/i)发生突变.为进一步研究半番鸭羽色MC1R基因单核苷酸多态性(SNP)奠定了基础;通过BLAST进行相似性搜索,结果表明,鸭与黑雁MC1R基因的核苷酸序列同源性最高为98.4%,与其他家禽的同源性也保持在92.8%～98.2%之间.可见禽类的MC1R基因编码区序列具有高度的保守性;系统进化分析表明,半番鸭、北京鸭与雪雁、黑雁、皇雁亲缘关系相近,从分子角度验证了它们在动物学分类上的地位.     

猪PDCD5基因的克隆与真核表达

用RT-PCR方法从猪肝组织中扩增出猪PDCD5(programmed cell death 5)编码序列,TA克隆至pMD-19T载体中,软件分析猪PDCD5基因的核算序列和蛋白序列,进行染色体定位.构建真核表达载体,将PDCD5基因编码区序列插入绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中.通过脂质体转染法将重组载体瞬转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs)进行瞬时表达.结果表明:该序列编码125个氨基酸,猪PDCD5基因定位于猪6号染色体,含有6个外显子,与人PDCD5基因高度同源.双酶切鉴定和测序表明:重组真核表达载体构建成功,荧光检测和Western blot检测显示PDCD5融合蛋白表达.研究结果为探讨猪PDCD5基因在细胞凋亡调控中的功能提供了基础数据.     

纳豆激酶基因的克隆及表达研究

经PCR扩增获得了纳豆激酶基因(NK).将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/NK.转化宿主菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下进行纳豆激酶的表达研究.SDS-PAGE电泳分析结果表明,重组蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在.     

胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因的克隆和表达

通过RT-PCR方法扩增出MPZJ1206株胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因,将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接获得重组表达质粒pGEX-VP1,进行条件优化诱导表达,将表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析。结果表明,分子量约为52 kDa的重组目的蛋白得到表达。该研究为开发胰腺炎型鸭1型甲肝病毒诊断方法和研究VP1蛋白功能奠定基础。