玉米大斑病菌黑色素合成酶基因的全基因组定位及表达模式分析

【目的】确定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）黑色素合成酶基因StPKS、St3HNR、St4HNR、StSCD、StLAC1、StLAC2在基因组中的位置和基因结构,分析黑色素合成途径中6个合成酶基因在玉米大斑病菌侵染过程中从分生孢子萌发至穿透不同时期及菌丝生长时期的表达模式,明确6个基因与病菌发育和致病的关系。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库,通过Blastp相似性搜索,鉴定6个基因在基因组中的定位,解析在基因组中的串联分布情况;收集玉米大斑病菌从分生孢子萌发到侵染的不同时期及菌丝生长时期的菌体材料,提取总RNA,以β-tubulin作为内参基因,根据黑色素合成6个关键酶基因序列设计引物,采用qRT-PCR技术检测基因的表达模式,对比病菌在营养生长和生殖生长时期的表达情况。【结果】在基因组数据库中,玉米大斑病菌黑色素合成酶基因StPKS、St3HNR分别位于scaffold_12的正链和负链上,St4HNR、StLAC2位于scaffold_11的负链上,StSCD位于scaffold_1正链上,StLAC1位于scaffold_7正链上,且StPKS和St3HNR在基因组中串联分布在26.9 kb范围内;6个基因的相对表达量在分生孢子诱导萌发到穿透过程的5个时期中呈上调-下调-上调或上调-下调-上调-下调两种模式;分生孢子时期,StLAC2表达量最高,明显高于其他基因,差异极显著;菌丝生长时期,St3HNR、StSCD表达量最高,明显高于其他基因,差异极显著。【结论】玉米大斑病菌6个黑色素合成酶基因中StPKS和St3HNR在基因组中位置邻近,串联在26.9 kb范围内;6个基因从分生孢子萌发至侵染的5个时期均有表达,表达量存在显著差异,但各基因的表达模式相似,说明6个基因参与了玉米大斑病菌的侵染过程,在玉米大斑病菌的致病方面具有重要作用;同时在菌丝生长时期St3HNR和StSCD发挥的作用更明显,分生孢子时期StLAC2更活跃。     

不同诱导因素对玉米大斑病菌附着胞产生的影响

 附着胞是许多叶部病原真菌的重要侵染机构。在不同温度、光照条件、基质和培养时间下,对玉米大斑病菌1号小种和2号小种分别在玻璃平板和玉米叶片上进行附着胞的室内诱导,发现分生孢子的水悬浮液在玻璃平板和玉米叶片的上表面及下表面都可产生附着胞,附着胞都能正常萌发并产生侵入丝,但在玉米叶片上附着胞和侵入丝的产生时间要晚于玻璃平板,产生数量也少。玉米大斑病菌分生孢子在PD培养基中产生的附着胞数目少于清水处理。影响玉米大斑病菌附着胞生长和发育的决定因素是温度,在玻璃平板上10～36℃培养24h后就可以产生附着胞,但最适宜的     

玉米大斑病菌St3HNR基因真核表达载体构建及表达分析

本研究在克隆获得玉米大斑病菌1,3,8-三羟基萘还原酶基因(St3HNR)的基础上,拟对该基因编码产物进行异源表达分析,明确基因功能.试验利用毕赤酵母真核表达系统,构建了玉米大斑病菌St3HNR基因的真核表达载体pPIC9K-St3HNR,采用电击转化法将重组质粒转入表达宿主菌GS115中得到了重组酵母菌株,经甲醇诱导...     

DHN黑色素与玉米大斑病菌附着胞膨压形成的关系

 【目的】探讨玉米大斑病菌胞内DHN黑色素在附着胞膨压产生过程中的作用,明确玉米大斑病菌的侵入机理。【方法】通过诱导玉米大斑病菌附着胞产生,确定附着胞形成的最佳条件,利用溶质排斥技术及incipient-cytorrhysis技术对玉米大斑病菌野生型菌株01-23和黑色素缺失突变体△St3hnr附着胞细胞壁孔径大小和膨压进行测定。【结果】野生型菌株01-23细胞壁孔径范围是2.1—2.7 nm,膨压在5.4 MPa左右;黑色素缺失突变体△St3hnr细胞壁孔径范围是2.7—3.3 nm,膨压在4.1 MPa左右;缺乏黑色素的附着胞不能形成高膨压,丧失了穿透能力。【结论】黑色素层对溶质分子外渗的阻挡作用导致了附着胞高膨压的产生,膨压产生的机械穿透力在玉米大斑病菌穿透基质平面的过程中发挥了重要作用。     

玉米大斑病菌生理小种鉴定续报

70年代国内对玉米大斑病菌生理小种鉴定结果表明:全国只有1号小种。80年代初辽宁省丹东市农科所报道:在辽宁省丹东地区存在2号小种。80年代末,试验鉴定结果:吉林省(6个地区)、黑龙江省(哈尔滨)、河北省(保定)、山东省(烟台)出现2号小种,本文是1988年、1989年两年鉴定结果。     

玉米大斑病菌原生质体的制备

以玉米大斑病菌(Exserohilum turcium)菌株9948N为供试菌株，进行了原生质体制备条件的研究。主要探讨了酶、渗透压稳定剂、温度、时间等条件对原生质体产出率的影响。结果表明玉米大斑病菌原生质体制备的适宜条件是：28℃下以10mg／mL纤维素酶 10mg／mL蜗牛酶的混合酶处理经过研磨的菌体，酶解72h，以0．8mol/L甘露醇做渗透压稳定剂。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS功能分析

[目的]利用RNA干扰技术探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS的功能.[方法]将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSi lent-1载体中,构建StPKS的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2.利用聚乙二醇(PEG)介导的方法将之转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,通过潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子中StPKS的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异.[结果]本研究构建了StPKS RNA干扰载体并进行了成功转化,经潮霉素抗性筛选和PCR验证最终获得了9个阳性转化子,其中5个转化子菌落颜色变浅.对转化子进行半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS表达量均有所下降;黑色素产量显著降低;菌丝呈不规则状,发生了膨大、变形、分枝等现象.[结论]StPES在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生.     

玉米大斑病菌的RAPD分析Ⅰ.应用CTAB法提取玉米大斑病菌DNA

用采自河北、辽宁、黑龙江、山东、吉林等５省的１４个玉米大斑病菌菌株为试材进行液体培养，然后采用ＣＴＡＢ法从菌丝中提取ＤＮＡ，通过７５２型紫外光栅分光光度计检测，最后将所提取的ＤＮＡ在热循仪ＰＥ－４８００上进行随机引物多态性扩增。结果发现，所提取的ＤＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值介于１．７３０－１．８４７之间，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后得到了较清晰的扩增图谱，从而证明了采用的ＣＴＡ法是提取玉米大斑病菌ＤＮＡ并用于分子生物学研究的一种行之有效的玉米。     

玉米大斑病菌小柱孢酮脱水酶StSCD家族鉴定及其功能分析

【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族,并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响,为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据,获得StSCD基因家族的全序列,并与玉米小斑病菌（Cochlibolus heterostrophus）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、瓜类炭疽病菌（Colletotrichum lagenaria）等真菌的SCD进行序列比对;收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析,获得不同时期、不同StSCD的表达量,从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因;使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌,测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等,确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD,其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性,StSCD4与多主棒孢（Corynespora cassiicola）中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现,在附着胞时期4个StSCD表达量均上调,其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著,附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降,并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后,黑色素合成受阻,附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD,推测StSCD4参与DHN（1,8-间苯二酚）黑色素的合成,并进而影响附着胞膨压积累。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

玉米大斑病菌有性态研究进展

玉米大斑病是一种严重的叶枯型病害,主要为害玉米叶片、叶鞘和苞叶。该病的病原分为无性态和有性态,有性态学名为Setosphaeria turcica,称玉米大斑刚毛座腔菌,属于异宗配合子囊菌。在自然界中尚未发现有性态的存在,但在实验室中可以诱导有性态的发生。在有性繁殖过程中,会发生遗传物质的重组,产生的杂交后代会出现新的致病小种或者扩大寄主范围。回顾了玉米大斑病菌有性态研究的历史,介绍了交配型鉴定的传统方法,并且得到了用分子生物学方法进行研究的最新结果。     

我国玉米大斑病菌生理小种种群动态分析

为明确近年来中国玉米大斑病菌（Setosphaeriaturcica）的生理小种变化和种群消长情况,分析玉米大斑病逐年加重的原因。采用常规Ht单基因（Ht1、Ht2、Ht3和HtN）鉴别寄主,对2005年和2006年采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、陕西、山西、河南、四川和北京-天津-唐山地区共10个省区28个地区的204个玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定;利用毒力频率法分析玉米大斑病菌的生理分化及其在中国的分布频率。结合前人研究结果,分析了近30年中国玉米大斑病菌生理小种变化趋势。共鉴定出0,1,2,3,12,13,23,123,23N共9个生理小种,其中0号小种和1号小种为优势小种,分别占供试菌株的62．25％和19．12％,其他小种占供试菌株的18．63％;所鉴定的204个菌株,对Ht1抗性基因的毒性频率最高,为33．33％;对HtN抗性基因的毒性频率最低,为1．47％;对Ht2和Ht3抗性基因的毒性频率分别为16．18％和6．37％。玉米大斑病菌生理分化明显,呈现复杂化,不断有新小种出现。Ht1和Ht2抗性基因在中国大部分玉米严区均有不同程度的抗性“丧失”。玉米大斑病菌新小种出现、0号和1号小种以外其他生理小种出现频率的的升高和品种抗性的“丧失”是玉米大斑病发生的重要原因。     

中国2001年玉米大斑病菌生理小种鉴定

利用含不同抗性基因的玉米作为鉴别寄主，对2001年分别采自于河北、辽宁、黑龙江等省的37个玉米大斑病菌菌株进行生理小种鉴定。鉴定结果表明，供试菌株中不仅有0号(原1号)、1号(原2号)小种，还出现了12，23，3N，12N号等其它生理小种。尤其是由于本试验出现了对带Ht抗性基因的玉米均致病的123N号生理小种，这应引起育种工作者的高度注意。     

2A型蛋白磷酸酶对玉米大斑病菌菌体发育的调控作用

【目的】明确2A型蛋白磷酸酶（PP2A）在玉米大斑病菌致病过程中的作用,为研发新型杀真菌制剂和探讨植物病害防治新策略奠定理论基础。【方法】利用不同浓度的PP2A特异性抑制剂——斑蝥素（cantharidin）处理玉米大斑病菌,研究在该抑制剂作用下玉米大斑病菌的菌落生长、分生孢子产量、孢子萌发、附着胞发育、黑色素合成及HT-毒素活性。【结果】随着斑蝥素浓度的增加,其对菌丝体生长的抑制作用也逐渐增强,当达到160 μmol•L-1时,培养8 d的菌落平均直径仅为对照的41.7%;同时,处理组产孢量均高于对照组,160 μmol•L-1斑蝥素处理组产孢量达到了对照组的15.5倍。分析斑蝥素对病菌分生孢子的萌发、附着胞形成及侵染的影响表明,上述3个阶段对斑蝥素的敏感性由强到弱依次为附着胞形成>分生孢子萌发>附着胞侵染;此外,对照组的胞内黑色素含量为0.13 g•L-1,处理组的胞内黑色素含量均高于对照组,且随着斑蝥素浓度的增加不断升高。【结论】PP2A特异性抑制剂斑蝥素对玉米大斑病菌菌落生长、附着胞发育具有抑制作用,而对分生孢子产生及胞内黑色素的合成具有一定的促进作用。     

MAPK途径对玉米大斑病菌HT-毒素产生和生物学活性的调控作用

【目的】通过研究促分裂原活化蛋白酶（MAPK）途径对玉米大斑病菌HT-毒素产生及生物学活性的影响,探索该途径对玉米大斑病菌致病性的调控机制。【方法】利用MAPK途径特异性抑制剂U0126分析该途径对玉米大斑病菌HT-毒素产生及活性的影响。【结果】1～20 μmol•L-1 U0126处理后,菌株01-23的HT-毒素组成和含量均发生了变化,部分组分的合成受到抑制,并诱导产生了一些新的毒素组分。1～20 μmol•L-1 U0126处理后获得的HT-毒素在感病寄主B37和B37Ht1玉米自交系上的生物学活性都受到了显著抑制,在B37玉米叶片上的抑制程度强于B37Ht1。随着U0126浓度的增加,菌株01-23的HT-毒素在玉米叶片上产生的坏死斑面积减小,抑制程度增加,但不能完全抑制病斑产生,10 μmol•L-1 U0126处理和20 μmol•L-1 U0126处理间差异不显著。【结论】MAPK信号转导途径对玉米大斑病菌HT-毒素的产生和生物学活性具有一定的调控作用,但HT-毒素的产生和活性还受其它因素影响,具有更复杂的调控机制。