高白度低PPO活性小麦种质筛选

本试验对142份小麦种质资源的面粉白度和多酚氧化酶（PPO）活性进行测定,结果表明：面粉白度值高于国家一级粉标准的有73份,占样本总数的51.4%;样本PPO活性低于100 AU.min-1.g-1有41份,占供试样本的28.9%;筛选出9份面粉白度值高于80%,且同时具有较低PPO活性（〈100 AU.min-1.g-1）的小麦种质,可作为小麦白度性状改良的遗传材料。     

小麦籽粒多酚氧化酶提取方法的比较研究

采用3种不同方法提取21个小麦品种籽粒的多酚氧化酶(PPO),以综合研究不同的提取方法与其活性的关系,结果显示:在3种提取方法中,用十二烷基硫酸钠(SDS)提取全麦粉PPO的活性平均值和变异系数最高,分别为57.2 U/(g.min)和77.7%;而用磷酸盐提取全麦粉PPO活性平均值为19.6 U/(g.min),变异系数为59.6%,低于前者。用磷酸盐提取完整籽粒的PPO活性平均值及变异系数最低,分别为5.1 U/(g.min)和16.7%。简单相关分析结果表明,分别用磷酸盐和SDS提取全麦粉PPO活性的相关性最好,相关系数达0.954;其次是磷酸盐提取的完整籽粒和SDS提取全麦粉的PPO活性的相关性,其相关系数为0.925;最小的是用磷酸盐分别提取完整籽粒和全麦粉PPO活性的相关性,相关系数为0.877。相关性均达极显著水平。同时研究了磷酸盐和SDS分别提取PPO活性的时间特性,结果表明:对于PPO活性差异较大的品种,其活性曲线的差别也较大;对于同一品种,这2种方法提取的PPO活性面积(活性曲线下包含的面积)也差异明显。上述说明磷酸盐缓冲液中加入SDS可有效地改善PPO的提取效果;不同品种、不同的提取方法,PPO的活性曲线也有明显差异。     

小麦多酚氧化酶（PPO）活性的SSR标记筛选鉴定与验证

 小麦多酚氧化酶（PPO）活性是引起面条和面团储存期间颜色褐变的主要因素。发掘可应用于籽粒PPO活性辅助选择的分子标记，将有助于小麦面粉颜色性状的遗传改良。本研究选用来自全国不同麦区的203份冬小麦品种，验证SSR（simple sequence repeat）引物Xgwm312的PCR扩增片段大小与籽粒PPO活性的关系。结果表明，198bp扩增片段的有无同籽粒PPO活性大小密切相关，该片段的出现通常意味着籽粒PPO活性较高。Xgwm312可应用于籽粒PPO活性的分子标记辅助育种。     

小麦籽粒PPO活性和戊聚糖含量对面粉白度影响

以不同类型小麦品种为材料,研究籽粒形成灌浆过程中多酚氧化酶（PPO）活性和戊聚糖含量动态变化,以及二者在籽粒中分布及其与面粉白度的关系。结果表明：小麦籽粒中PPO主要分布在籽粒外层,面粉白度和籽粒中PPO活性呈极显著负相关,面粉中PPO活性与面粉白度呈负相关,但不显著;籽粒形成与充实过程中,PPO活性呈先上升后下降再上升趋势,开花至花后21 d左右时,呈先上升后下降趋势,花后21 d PPO活性迅速上升,至成熟期达最大值;戊聚糖在小麦籽粒中的分布具有由内到外逐渐增加的特性,面粉和麸皮中戊聚糖含量与白度呈显著负相关,随着戊聚糖含量的增加,面粉白度逐渐降低,不同小麦品种籽粒戊聚糖含量的动态变化表现较为一致,均呈先上升后下降再上升趋势。     

小麦籽粒多酚氧化酶活性的QTL分析

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是引起面团(片)颜色褐变的主要原因。由小麦品种花培3号和豫麦57杂交获得DH群体168个株系,种植于2年6个环境中,利用324个多态性标记构建遗传连锁图谱,对小麦多酚氧化酶活性进行QTL分析。利用完全区间作图法,共检测到15个加性效应位点,其中2D染色体上主效QTL(标记Xcfd168-Xbarc349.2)在4个环境下均能被检测到,贡献率为11.65%~65.84%,适用于分子标记辅助育种。     

贵州小麦品种(系)籽粒低PPO活性种质资源筛选

[目的]筛选出小麦籽粒低多酚氧化酶(PPO)活性的种质资源,为贵州小麦籽粒品质的遗传改良及育种提供参考依据.[方法]以生产中表现优异的135份贵州小麦品种(系)为材料,采用苯酚染色法进行染色,在此基础上以STS分子标记(PPO16、PPO18和PPO29)检测小麦PPO活性相关基因,并通过Fragment AnalyzerTM毛细管电泳鉴定相关基因,进而对小麦籽粒低PPO活性基因的组成进行鉴定和筛选.[结果]135份小麦材料籽粒经苯酚染色后,有4份材料未染色(A级),9份呈浅绿色(B级),65份材料呈棕色(C级),57份材料呈黑色(D级).STS分子标记检测结果表明,在A级和B级材料中检测到10份材料含Ppo-A1b基因、4份材料含Ppo-D1a基因,其中4份材料同时含有Ppo-A1b/Ppo-D1a基因,分别是贵麦2号、惠水1-23、石无芒和08-9选单-2-7;在C级材料中检测到3份材料含Ppo-A1b基因、17份材料含Ppo-D1a基因,其中1份材料(贵农08-9)同时含有Ppo-A1b/Ppo-D1a基因;在D级材料中均未检测到Ppo-A1b和Ppo-D1a基因.[结论]采用苯酚染色法结合STS分子标记检测可对小麦籽粒是否含低PPO活性基因进行准确鉴定.贵麦2号、惠水1-23、石无芒、08-9选单-2-7和贵农08-9等5份含有双低PPO活性基因(Ppo-A1b/Ppo-D1a)的种质资源,可作为亲本材料直接用于小麦籽粒低PPO活性遗传改良及新品种选育.     

小麦籽粒PPO活性分子标记研究

为筛选出更实用的小麦籽粒多酚氧化酶(PPO)活性分子标记,试验根据P PO基因的EST序列设计引物,以PPO活性差异较大的2组材料基因组DNA为模版进行PCR扩增,对小麦籽粒PPO活性分子标记进行了研究。结果表明,引物PPO 18扩增产物的电泳带型在2组材料间存在明显差异,其在高PPO活性的材料中均扩增出685 bp片段,在低PPO活性的材料中均扩增出876 bp片段,相差191 bp。在所扩增的P PO基因序列中存在两个内含子(内含子Ⅰ和内含子Ⅱ),其中内含子Ⅰ符合内含子的GT-AG法则,在不同PPO活性材料间存在191 bp的DNA序列差异,与扩增片段的长度差异相吻合;内含子Ⅱ为‘GC-AG’型内含子,没有内含子的‘GT-AG’典型特征。在所扩增的P PO基因序列外显子区段,不同PPO活性材料之间存在两个单核苷酸多态性位点(SNP)。PPO 18及其所标记的P PO基因定位于2AL染色体上。结果表明,PPO 18标记是共显性、可靠、简便、实用的功能标记,可用于小麦种质资源评价和育种后代标记的辅助选择。     

小麦多酚氧化酶研究进展

小麦面粉和面食品的色度是小麦磨粉品质和面食品的主要评价指标。特别是面条、馒头、饺子、烙饼等中式食品对白度的要求相当高。多酚氧化酶(PPO)与小麦面粉及其面食品在加工、贮藏中的褐变直接相关。同时,多酚氧化酶种类的遗传变异和表达差异也决定小麦籽粒中的PPO总活性高低,从而直接或间接影响面粉的白度。笔者综述了近年来小麦多酚氧化酶生化机理、分布和分子生物学遗传分析以及与品质关系等方面的研究进展,并且根据多酚氧化酶的表达特性,讨论了小麦高白度新品种选育的策略。     

不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较

小麦多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性是引起面制食品褐变的主要原因.测定PPO活性有不同的检测方法,主要包括底物、吸收波长及样品选择的不同.本研究对不同小麦PPO活性检测方法进行了分析对比研究.结果表明,以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大.面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大,所以针对不同的筛选目的和要求,可以选用不同的PPO活性测定方法.     

小麦籽粒多酚氧化酶活性变化研究

为找出小麦籽粒多酚氧化酶活性变化规律,以不同品种为材料,研究了小麦籽粒发育及萌发期PPO活性的变化。结果表明,籽粒不同发育时期PPO活性存在显著差异;基因型与发育时期互作,PPO活性差异不显著;籽粒从开始灌浆到成熟,PPO活性变化趋势是先降低然后又升高,但品种间变化幅度不同;小麦籽粒萌发过程中PPO活性也是不稳定的,籽粒萌发过程中,品种之间和萌发期之间PPO活性都有显著差异。     

用RNA干涉对几个水稻WD结构域基因的功能研究

为研究水稻中WD结构域基因的功能,构建了8个WD结构域基因的RNA干涉转化载体并转化水稻品种.其中6个基因获得了转化体,3个基因(代号为E10,G04,和G05)的转化体出现表型变异.E10和G04的转化植株表现为花柱数目增加,E10转化植株的花柱基部还长出1条半透明物体;G05的转化植株表现为花粉不育.对转化植株的靶基因进行RT-PCR检测表明,大部分转化植株的内源基因表达量降低或没有表达.这些结果表明,这些WD结构域基因的功能与生殖发育有关.     

小麦PPO基因等位变异及面粉白度特性分析

利用分子标记PPO18和STS01对173份供试小麦品种Ppo 2A和Ppo 2D位点的等位基因变异进行分子检测,并根据品种间不同PPO等位基因组合类型将供试小麦品种进行分类,同时对多酚氧化酶PPO活性进行生化测定及面粉白度测定分析。结果表明,173份小麦品种共检测出Ppo A1b/Ppo D1a、Ppo A1b/Ppo D1b、Ppo A1a/Ppo D1a和 Ppo A1a/Ppo D1b 4种等位基因组合类型,且各基因组合类型出现的频率分别为38.7%、13.9%、35.8%和11.6%;供试小麦品种不同位点PPO等位基因出现的频率差异较大,2A位点等位基因Ppo A1a、Ppo A1b出现频率相近,而2D位点等位基因Ppo D1a出现频率是Ppo D1b的3倍;所测定的173份小麦品种PPO活性均值为117.3A₄₇₅/(min·mg) ,其中低PPO品种所占比例较高;4种基因组合类型PPO活性顺序为Ppo A1a/Ppo D1b>Ppo A1a/Ppo D1a>Ppo A1b/Ppo D1b>Ppo A1b/Ppo D1a ,且彼此间差异均达到显著水平(P<0.05);供试小麦的面粉白度均值为73.0%,达到国家面粉白度等级一级标准的品种38份,占供试小麦总数的22.0%;其中基因组合为Ppo A1a/Ppo D1b的品种面粉白度显著低于其他3种基因组合。总体来看,供试的小麦品种间面粉白度及籽粒PPO活性变异范围较广,面粉白度与PPO活性呈显著负相关,且控制PPO的主效基因的等位变异对PPO活性及面粉白度均有显著影响。对供试小麦品种的面粉白度、PPO活性表现及PPO等位基因组合类型进行综合考察,筛选出23份具有高白度低PPO活性的小麦品种,可以作为高白度低PPO活性小麦育种的亲本材料。     

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA（shRNA）的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50％,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。     

siRNA干涉禽流感病毒PA基因在鸡胚成纤维细胞中的表达

用阳离子脂体质转染试剂将人工合成的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)转染鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明,针对禽流感病毒(AIV)H5N1亚型核蛋白(NP)基因的siRNA能在AIV感染后1,2,3 h显著抑制NP基因的表达,表达水平分别降低3,1.4和2.5倍.     

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5）,测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T₂/T₃转基因大麦基因组。随机选取6个T₃转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T₁和T₃籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN₂及HN₃处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移（HN₂到HN₃）,该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。     

白背飞虱酚氧化酶原PPO基因特性及其免疫应答

【目的】酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱(Sogatella furcifera)3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的dsRNA作为对照组,通过注射合成的ds SfPPO后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】...     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制,广泛地存在于真菌、植物和动物中。主要介绍了RNAi的发现、分子机制、转基因载体构建策略以及RNAi在生命科学中广阔的应用前景。     

部分新疆小麦材料多酚氧化酶活性基因分布规律研究

[目的]了解新疆小麦材料多酚氧化酶(PPO)活性基因的等位变异组成和分布以及与PPO活性的关系,为小麦PPO活性的分子标记辅助选择奠定基础.[方法]利用PPO基因的功能标记PPO18、PPO29和PPO16对445份新疆冬春小麦材料进行2A和2D染色体上PPO等位基因Ppo -A1a、Ppo - A1b、Ppo - D1a和Ppo - D1b的检测,分析不同等位变异与PPO活性的相关性及变化趋势.[结果]PPO18在等位基因Ppo-A1a(高PPO)和Ppo - A1b(低PPO)中的分布频率为73.03;和26.97;,PPO16和PPO29在等位基因Ppo-D1a(低PPO)和Ppo - D1b(高PPO)中的分布频率76.63;和23.37;.Ppo -A1a与Ppo -A1b基因型的PPO活性平均值差异达极显著水平(P＜0.01).而Ppo- D1a与Ppo - D1b两者基因型的平均PPO活性差异不显著(P0.05);两个PPO基因的等位基因组合类型分布频率为:Ppo -A1a/Ppo - D1a(54.38;)、Ppo - A1a/Ppo-D1b( 18.65;)、Ppo -A1b/Ppo - D1a(22.25;)和Ppo -A1b/Ppo -D1b(4.72;);同时冬春小麦材料间PPO活性基因分布存在明显差异,总体来看,新疆小麦材料中高PPO活性的等位变异类型所占比例较高.[结论]PPO18、PPO16和PPO29标记可以作为小麦材料PPO活性鉴定有效工具.可直接利用此标记进行标记辅助选择.     

RNA干涉技术研究进展

RNA干涉是由双链RNA引起的转录后基因沉默机制.RNAi作为一门新的基因沉默技术,具有序列特异性和高效性等许多优点,在基因功能研究、疾病治疗、药物开发等方面具有广泛的应用.综述RNAi现象的发现、发生机制及其应用,并展望未来的研究.     

RNAi的研究进展(英文)

RNAi是由与靶基因同源的内源或外源双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)所引发的一种在动植物中普遍存在的基因沉默现象。它最早在植物体中被发现,现在已发展成为一种生物技术,并成为了后基因时代的重要研究手段。对RNAi技术在生物基础、医学、药学、植物学等领域的研究成果进行了综述。