柽柳rd22基因的序列分析及耐盐性研究

【目的】验证从抗逆植物柽柳中克隆得到的rd22基因的耐盐能力。【方法】采用根癌农杆菌介导法,对烟草进行rd22基因的遗传转化,将分子检测为阳性的6个转基因烟草株系和非转基因对照烟草的组培苗进行盐胁迫(NaCl浓度分别设为0(CK),110,220和330 mmol/L)试验,通过观察相对电导率、SOD活性和相对生长量的变化,研究rd22基因的耐盐能力。【结果】生物信息学分析表明,来自柽柳的rd22基因属于BURP蛋白家族。分子检测证明,该rd22基因已整合到烟草基因组中,并在mRNA水平上有不同程度的表达。相对电导率和SOD活性分析表明,随着盐胁迫浓度的增加,各转基因烟草株系的相对电导率均呈上升趋势,且均小于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330mmol/L时,非转基因对照烟草的相对电导率高达16.49%,而各转基因烟草的相对电导率最大为14.91%。各转基因烟草株系的SOD活性也随着盐胁迫浓度的增加均呈上升趋势,且均大于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330 mmol/L时,转基因烟草SOD活性是对照烟草的1.10~1.39倍。相对生长量分析表明,盐胁迫浓度达到110,220,330mmol/L时,各转基因烟草株系相对生长量均高于对照株系,非转基因烟草的相对生长量分别为59.92%,36.99%和12.72%,转基因烟草的相对生长量平均为67.00%,44.05%和17.47%。【结论】rd22基因的导入,提高了转基因烟草的耐盐性。     

苹果HYL1基因在干旱中的表达与功能分析

【目的】分析干旱处理下苹果HYL1基因(MdHYL1)在苹果中的表达情况,并初步分析过量表达MdHYL1转基因苹果根系的生长情况,以了解MdHYL1在干旱中的功能特性。【方法】从金冠苹果中克隆出MdHYL1基因,对其进行干旱下的表达分析、系统进化分析和组织特异性表达分析;利用Gateway技术构建植物过表达载体pGWB414-MdHYL1,通过根癌农杆菌介导法转化苹果无性系GL-3,经卡那霉素筛选,采用PCR和RTqPCR技术鉴定阳性转基因株系,并对转基因株系的根系生长情况进行观测。【结果】MdHYL1包含长1 479bp的完整开放阅读框,编码492个氨基酸,位于chr15染色体上;系统进化树分析表明,苹果MdHYL1与梅PmHYL1、桃PpHYL1蛋白的关系最近;组织特异性表达分析表明,MdHYL1基因在楸子各组织器官中的表达量为叶茎花根果实;干旱处理下MdHYL1基因的表达量显著上调,而转基因植株鉴定结果表明,MdHYL1基因已成功转入苹果植株中,3个过表达MdHYL1转基因株系的根系较未转基因株系(对照)明显增多。【结论】MdHYL1基因能够响应干旱胁迫,且转基因苹果根系更发达,表明其可能在苹果耐旱过程中起重要作用。     

油松PtNF-YC1基因鉴定及其调控球花发育的作用机制研究

【目的】针叶树中NF-Y核因子调控球花发育的研究尚未见报导,对油松PtNF-YC1基因克隆、表达特性及功能分析,旨在为针叶树NF-Y基因家族在球花生殖发育中的功能研究提供依据。【方法】（1）利用系统进化树分析油松PtNF-YC1与拟南芥NF-YC亚家族蛋白的亲缘关系;（2）瞬时转化烟草检测PtNF-YC1的亚细胞定位;（3）根据转录组数据分析PtNF-YC1在油松不同组织中的表达特性;（4）PtNF-YC1异源转化拟南芥,分别比较长日照和短日照条件下转基因拟南芥不同株系的开花时间,并对长日照下各株系进行转录组测序,筛选响应PtNF-YC1调控开花的相关基因;（5）通过Y2H和BiFC验证PtNF-YC1与候选蛋白之间互作。【结果】PtNF-YC1基因的开放阅读框为897 bp,编码299个氨基酸,含有典型NF-YC保守结构域,与AtNF-YC3/4/9具有较高同源性。亚细胞定位结果显示,PtNF-YC1定位在细胞核和细胞质。PtNF-YC1在针叶、营养芽、雌雄花芽和根中都能表达,但在雄球花中表达丰度最高。PtNF-YC1异源转化拟南芥可推迟其短日照下开花时间。Y2H和BiFC证明PtN...     

异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IrrE编码蛋白;通过NaCl和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性,通过测定抗逆相关生理指标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造,共优化了241个密码子;构建了高效植物表达载体GBI-IE;利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗,并通过PCR验证共获得15个独立的转基因株系;通过q RT-PCR分析从中选取两个表达量最高的株系GO1和GO2进行后续的抗逆性分析;Western blot验证IrrE编码蛋白在GO1和GO2中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析:种子萌发试验表明,正常1/2 MS培养基上,转基因株系GO1和GO2发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而250 mmol·L~(-1)NaCl培养基上GO1和GO2萌发率分别为78.8%和90.0%,野生型仅为10.3%,分别提高了68.5%和79.7%。类似地,300 mmol·L~(-1)甘露醇条件下,野生型的萌发率为39.7%,转基因株系GO1和GO2分别提高了42.9%和50.8%;正常萌发的种子移栽到250 mmol·L~(-1) NaCl和300 mmol·L~(-1)甘露醇条件12 d后,转基因株系根长、侧根数以及鲜重等生理指标显著高于野生型对照;温室中正常生长30 d的苗期烟草在250 mmol·L~(-1) NaCl处理下,转基因烟草SOD、CAT活性比野生型对照分别提高了48.80%和88.55%,而MDA含量比野生型对照降低了61.61%,胁迫响应基因Nt ABF2、Nt LEA5、Ntzfp、Nt CDPK2在GO1和GO2转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐处理结果类似,300 mmol·L~(-1)甘露醇的处理下,转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】烟草中异源表达耐辐射异常球菌irrE可以显著提高耐盐耐旱性;其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作为植物耐逆基因工程的优良基因源。     

秋茄KcTIP1基因克隆及其对植物耐盐性作用的研究

【目的】从秋茄中克隆液泡膜水通道蛋白KcTIP1基因,并研究其对植物耐盐性的作用机制。【方法】以秋茄幼嫩叶片为材料,通过PCR扩增克隆KcTIP1基因并构建其表达载体,采用根癌农杆菌介导法,用含重组质粒的农杆菌转化烟草植株,通过卡那霉素筛选和转基因烟草基因组PCR、RT-PCR鉴定,获得转基因再生植株;并选取其中2个阳性株系和野生型株系进行盐处理,测定野生型烟草(对照)与盐处理烟草根、茎、叶鲜质量,光合参数,叶片组织Na+、K+浓度以及根尖Na+、K+的流速。【结果】成功克隆得到了KcTIP1基因,对其编码蛋白氨基酸序列进行分析表明,秋茄KcTIP1包含MIP家族的特征序列SGGHVNPAVT和2个保守的NPA(Asn-Pro-Ala)位点。RT-PCR检测结果显示,KcTIP1基因在转基因烟草株系中成功表达。盐胁迫后,转基因烟草植株根、茎、叶鲜质量,叶片净光合速率,蒸腾速率,叶片组织Na+、K+积累和根尖Na+、K+内流幅度均高于野生型烟草。【结论】KcTIP1具有与其他水通道蛋白类似的蛋白结构和酶学功能,KcTIP1基因过表达可以提高转基因烟草的抗盐能力。     

华东葡萄抗白粉病VpMYBR1基因表达与功能分析

【目的】从华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’中克隆VpMYBR1基因,并进行基因表达与功能分析,为揭示抗白粉病机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE技术克隆VpMYBR1 基因cDNA全长序列,并利用半定量和定量RT-PCR技术进行不同器官和不同处理后的表达分析;通过花序浸染法转化拟南芥,对转基因及未转化对照植株抗白粉病鉴定、台盼蓝染色和抗病标记基因表达分析研究基因功能。【结果】VpMYBR1基因cDNA序列全长539 bp,有228 bp的完整开放阅读框,编码75个氨基酸,包含1个Sant/myb结构域,GenBank 登录号为HQ284197;VpMYBR1基因在‘白河-35-1’不同器官中均有表达,且叶中的表达量最强,花序和果实中表达量最弱;VpMYBR1基因的表达在抗白粉病的华东葡萄‘白河-35-1’与感病的‘湖南-1’、抗病的毛葡萄‘商-24’叶片接种白粉菌6 h后达到最大值,而且在‘白河-35-1’中最高,达接种前的28倍。同样,VpMYBR1基因在SA、MeJA处理后的‘白河-35-1’中的表达量明显高于‘商-24’和‘湖南-1’;将VpMYBR1基因导入野生型拟南芥,提高了转基因株系的抗病性;台盼蓝染色和抗病标记基因表达分析表明,该基因可能通过过敏反应（hypersensitive reaction, HR)提高了转基因株系的抗病性。【结论】从华东葡萄克隆了VpMYBR1基因,基因表达及功能分析表明,该基因具有提高转基因植株白粉病抗性的功能。     

苹果MpSnRK2.4基因的克隆及转化

【目的】从常用苹果砧木楸子中克隆MpSnRK2.4基因,并将其转化番茄(Lycopersicon esculentum)品种Micro-Tom,为研究其功能奠定基础。【方法】以楸子幼叶为材料,通过RT-PCR扩增获得MpSnRK2.4基因的完整开放阅读框序列;利用Gateway技术构建pGWB411-SnRK2.4植物过表达载体,通过根癌农杆菌介导法将此载体转入Micro-Tom番茄中,通过卡那霉素筛选和转基因番茄RT-PCR鉴定,获得阳性转基因株系,利用qRT-PCR技术研究不同转基因株系中MpSnRK2.4基因的表达水平。【结果】成功克隆到长度为1 220bp的MpSnRK2.4基因片段,该基因包含长1 026bp的完整开放阅读框,编码341个氨基酸残基。通过在线软件分析发现,该基因的gDNA序列包含8个内含子,9个外显子;预测编码蛋白MpSnRK2.4的分子质量为38.475ku,理论等电点(pI)为6.06。系统进化树分析表明,MpSnRK2.4与水稻OsSAPK3蛋白的亲缘关系最近,序列比对显示MpSnRK2.4蛋白与已知的其他植物SnRK2s蛋白序列具有较高的同源性。转基因植株PCR鉴定结果表明,MpSnRK2.4基因已成功转入番茄植株中,经qRT-PCR发现,不同转基因株系的MpSnRK2.4基因表达量存在差异,其中株系1的表达水平最高。【结论】克隆获得了MpSnRK2.4基因全长序列,并得到了10个含有该基因的Micro-Tom番茄转基因株系。     

3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因的克隆与分析

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的表达量最高;3个基因都能被多种非生物胁迫（盐、干旱、铝）和激素（脱落酸、赤霉素、乙烯利、水杨酸和茉莉酸甲酯）诱导,但表达模式不同。在盐浓度为200 mmol•L-1的筛选培养基上只有导入目的基因的愈伤组织能产生不定芽,250 mmol•L-1 NaCl处理再生植株10 d,转基因植株和野生型植株叶片的电导率和可溶性糖含量均呈现上升趋势,但野生型植株叶片的电导率显著高于转基因植株,可溶性糖含量则显著低于转基因植株（P＜0.05）;转基因植株和野生型植株叶片的叶绿素含量均呈现下降趋势,野生型植株叶片叶绿素含量显著低于转基因植株（P＜0.05）;盐胁迫条件下,转化不同基因的再生植株的电导率、叶绿素和可溶性糖含量没有显著差异（P＞0.05）。【结论】3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因都不包含内含子,其表达具有组织特异性,都能被多种非生物胁迫和激素诱导,能够使烟草愈伤组织在含盐培养基上形成不定芽并最终产生转基因植株,且转基因植株的耐盐性高于野生型植株。     

甘蓝SLR1启动子在烟草及芥菜中的表达分析

为研究甘蓝SLR1启动子在异源植物中的表达特点,将GUS报告基因在1.5kb长的SLR1启动子驱动下,通过农杆菌介导法分别导入烟草和芥菜.转基因植株经PCR鉴定显示GUS报告基因已经整合到烟草和芥菜基因组中.转基因植株开花后花器官组织的GUS化学染色分析结果显示SLR1启动子主要在烟草和芥菜开花前2天至开花后的柱头中大量表达,部分转基因烟草植株开花后的花冠,转基因芥菜植株花萼、花瓣及花丝中也有明显的表达,但在两种转基因植株花粉中均未检测到GUS表达活性,显示甘蓝SLR1启动子在异源植物中不是一个严谨的柱头特异启动子.     

野生茄子托鲁巴姆StLTPa7的克隆与分析

【目的】从野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）中克隆非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7 cDNA,并解析其功能。【方法】采用同源基因设计引物,并根据RT-PCR方法克隆StLTPa7 cDNA序列;通过农杆菌浸染法转化烟草,构建StLTPa7过表达转基因烟草植株;采用菌丝生长速率法检测转基因烟草植株蛋白提取物对大丽轮枝菌的体外抑菌活性。【结果】托鲁巴姆中克隆获得1个StLTPa7 cDNA序列,该序列含有1个345 bp的开放阅读框,推测编码长114个氨基酸的蛋白,相对分子量为11.42 kD,理论等电点为9.01。StLTPa7受水杨酸（SA）和大丽轮枝菌诱导表达,在处理后24和48 h的表达量较高。为了分析StLTPa7对大丽轮枝菌的抗性,构建了过表达转基因烟草植株,共获得了4个PCR阳性转StLTPa7烟草株系。荧光定量PCR分析显示,该基因在转基因烟草株系L5和L7中过量表达。抑菌试验显示,转基因烟草株系L5蛋白提取物对大丽轮枝菌的抑菌率约为对照的2.5倍。【结论】从野生茄子托鲁巴姆中克隆到1个StLTPa7 cDNA序列,该基因与大丽轮枝菌的生长和增殖的抑制作用相关,可能参与植物对大丽轮枝菌的防卫过程。     

成花素基因PdFT的克隆及其对牡丹成花的影响

【目的】克隆紫牡丹FT同源基因,分析其表达模式以及对紫牡丹成花的调控作用。【方法】以紫牡丹为试验材料,通过RT-PCR的方法克隆紫牡丹FT同源基因PdFT。通过实时荧光定量PCR分析PdFT在紫牡丹不同组织、紫牡丹开花物候期各过程及不同处理的表达情况,并探讨PdFT与花芽发育状态的关系。同时,将克隆到的紫牡丹PdFT克隆到表达载体pET-28a上,构建融合表达载体pET-28a-PdFT,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】克隆得到包括完整开放阅读框（ORF）的PdFT cDNA序列,ORF长度为522 bp,编码173个氨基酸,GenBank登录号为KF113360。氨基酸序列比对表明：PdFT蛋白具有一个典型的PEBP结构域,属于PEBP家族;并且与GenBank中已克隆的FT同源基因具有高度的同源性。实时荧光定量PCR分析结果表明,PdFT在紫牡丹根、茎、叶、芽中均有表达,芽中表达量最高,叶中表达量最低。紫牡丹开花物候期各过程PdFT的表达分析表明,在花芽膨大期表达量最高,随着花蕾的发育,PdFT的表达量逐渐降低。PdFT在不同光照温度条件下的表达分析表明,短日照和低温处理均抑制PdFT基因的表达。不同状态花蕾中PdFT的表达分析结果表明,败育花蕾PdFT的表达量低于正常花蕾。同时,GA3及去叶处理均能提高PdFT的表达量。所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】紫牡丹PdFT与已克隆的FT同源基因高度同源,属于FT亚家族,在紫牡丹顶芽中表达量最高,可能调控牡丹开花,PdFT的克隆及表达分析为研究紫牡丹成花的分子机理奠定了基础。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

树上干杏开花坐果期内源激素变化规律

【目的】测定树上干杏开花坐果期3种内源激素含量的动态变化,研究内源激素对树上干杏开花、落花及坐果的调控机制,为树上干杏内源激素在花期调控,提高杏坐果提供理论基础。【方法】以10年生树上干杏植株为材料,分别于花期、坐果期,采集花芽、花朵或幼果,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定其内源激素赤霉素(GA₃)、油菜素内酯(BR)和脱落酸(ABA)的含量。【结果】内源激素GA₃含量194.12 ~511.17 pg/mL范围内,对花芽的发育起促进作用,幼果的发育需要较高水平的GA₃;内源激素BR(125.8~153.65 ng/L)对花芽发育以及成花具有促进作用,坐果期初期较高含量的BR可能利于幼果的发育;低含量(72.71 ~105.12 μg/L)的ABA可能利于花芽萌动,激素间相关性分析显示ABA与BR含量、ABA与GA₃含量、BR与GA₃含量极显著相关。【结论】花芽膨大期初期GA₃含量最低,盛花期末期达到峰值,之后呈下降趋势;内源激素BR含量在露萼期和盛花期出现峰值,从盛花末期开始下降;花芽膨大期ABA含量处于低水平状态,之后总体为上升趋势,盛花末期ABA含量达到峰值后下降。高含量的ABA可能会促进杏花开放衰老,低水平的ABA可能利于幼果生长发育。     

过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP（stress-associated protein）是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100 μg•mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol•L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05 cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U•g-1 FW和8.37 %,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg•g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg•g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol•g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol•g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。     

光皮桦BlFTL基因的克隆和表达模式

通过反转录-聚合酶链式反应（RT?鄄PCR）结合如cDNA末端快速克隆（RACE）技术从光皮桦Betula luminifera中克隆到1个FT类似基因,命名为BlFTL。该基因cDNA全长为924 bp（GenBank登录号:JQ951966）,包含1个525 bp的开放阅读框（116~640 bp）,编码1个含174个氨基酸的蛋白,且具有FT蛋白典型的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）结构域。与已有部分植物中FT蛋白同源比对结果显示,BlFTL与无花果Ficus carica中FcFT序列相似性最高,达到了94%。4月为光皮桦开花期,雌花中BlFTL基因的表达量最高,茎和叶片中表达量很低。比较正常开花和不开花无性系植株嫩茎和叶片在不同时间BlFTL基因的表达情况,结果表明:BlFTL在不开花无性系植株中基本不表达,而正常开花植株中,BlFTL主要在雌花序和混合芽形成的8月以后表达。图8参13     

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长DNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR 和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号：HQ444960, CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI＝5.66,分子量MW＝53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop 环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。     

CaMV35S启动子驱动的FT基因调控杨树早期开花的初步研究

为了研究CaMV35S启动子驱动的FT基因对转基因杨树Populus早期开花的影响,利用Gateway技术构建了35S::FT基因表达载体,并对杨树进行了遗传转化,从转基因杨树花的发育、花器官变异等方面初步探讨了35S::FT促进杨树早期开花性能。结果表明:35S::FT转基因杨树分生组织属性的改变及初始花结构的形成发生于试管培养阶段;花开始发育后如不及时把开花植株继代培养或转至土壤温室培养,初始花结构会凋谢枯萎,不能继续发育。转基因植株花器官的分化与发育发生于温室培养阶段的3~5周内,能够分化出典型的花器官,但发育不完全,具雌雄蕊、花盘结构,无成熟苞片结构,雄蕊不能成熟发育。35S::FT诱导的花均为单朵花,而非野生型的柔荑花序;多数花属于单性花,但转基因雄性无性系中会出现两性花。转基因植株的开花率随着试管苗继代次数的增加而急剧下降,但两性花比例会上升。     

棉花转录因子基因GhMS3的克隆及其启动子功能的鉴定

【目的】从棉花无短绒突变体GZnn中分离棉纤维发育相关的转录因子,并对其转录激活功能和表达模式进行初步分析。【方法】通过RACE(rapid amplification of the cDNA ends)和染色体步行(genome walking)技术,获得GhMS3的cDNA序列及基因组DNA序列。利用生物信息学方法对获得的DNA序列及推定的氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交系统验证GhMS3蛋白的转录激活功能,运用GUS组织化学染色法在转基因烟草中分析该基因的表达模式。【结果】获得GhMS3的基因组DNA以及上游1174bp的启动子序列。氨基酸序列比对发现GhMS3是R2R3 MYB转录因子。酵母试验表明,GhMS3蛋白具体外转录激活功能,C端体外转录激活功能较强,在PGhMS3:GUS转基因烟草中,GUS主要在表皮毛、根毛以及细胞分裂旺盛区域表达。【结论】从棉花无短绒突变体GZnn中分离到的R2R3 MYB转录因子GhMS3,具有组织特异性表达模式并且其编码蛋白具有体外转录激活功能,是否参与植物表皮细胞分化有待于进一步研究。     

早花基因（FT）介导的烟草快速回交改良研究

【目的】针对常规回交育种周期较长的问题,以烟草为模式植物,探索快速回交改良作物的有效方法。【方法】以对TMV免疫的烤烟品种Fc8作为抗性供体亲本,以综合性状优良但感TMV的中烟100为受体亲本进行回交改良及种质创新。首先从拟南芥中克隆早花FT,将其连接到植物表达载体P22上,并转入农杆菌中,采用叶盘法转化烟草Fc8,创建含FT的Fc8阳性植株。阳性植株分别与中烟100杂交,根据F₁后代群体中早花基因的分离比例,鉴定筛选含单拷贝FT的阳性植株。接下来,从含单拷贝FT的阳性植株的F₁群体中选择早花植株,与中烟100回交,根据回交分离群体中FT早花基因与TMV抗性N基因的分离比例,筛选FT与N基因不连锁的阳性植株。选择该阳性植株与中烟100连续回交。在每一回交分离世代中,选择早花且含有TMV抗性标记的植株连续回交,当后代遗传背景大部分与中烟100相近,并保留TMV抗性时选择非早花且含N基因标记的植株,鉴定无FT、Ubi启动子、Nos终止子和Hyg筛选标记等转基因元件后,连续自交纯化,筛选改良的创新种质。【结果】通过转基因技术共获得8株含FT的Fc8阳性植株,经鉴定获得一个含单拷贝FT,且FT和TMV抗性N基因不连锁的Fc8植株。用该植株作为TMV抗性的供体亲本回交改良中烟100,一年多时间已回交加代到BC₄F₁,比常规回交育种时间缩短450-500 d。早花基因在杂交、回交各世代均能稳定表达,早花植株在苗龄50-60 d现蕾开花,早花植株现蕾开花时,一般有3-4片叶,株高平均约35 cm,同期非早花植株高约27 cm,仍然处于营养生长阶段。非早花植株在苗龄130-140 d现蕾开花,平均株高约120 cm,叶片数18-20片。FT能使植株花期提前70-90 d,缩短世代周期约一半时间;早花加代结合TMV分子标记筛选得到了BC₁、BC₂、BC₃代TMV抗性烟草新种质。【结论】借助FT介导的早花及抗TMV基因分子标记,能有效地缩短烟草TMV抗性回交育种周期、加快回交育种进程,虽利用转基因技术但可获得不含有任何转基因元件的创新种质。