多年生黑麦草P5CS基因的cDNA克隆、表达及亚细胞定位

以多年生黑麦草(Lolium perenne)‘Derby'为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶基因(P5CS)的cDNA序列,全长2528bp,推断其编码716个氨基酸,命名为LpP5CS。序列分析表明:LpP5CS基因与小麦TaP5CS和水稻OsP5CS基因核苷酸序列的相似性分别为92.05%和85.82%,氨基酸序列的相似性分别为93.99%和87.99%。半定量PCR结果表明,LpP5CS基因在多年生黑麦草根、茎,叶均有表达。盐处理下,表达量高于对照,其中叶片中表达量最高,根中最低。200mmol·L-1NaCl处理下,LpP5CS基因表达量随处理时间延长,有先升高后降低的趋势。洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达显示,LpP5CS蛋白定位于细胞膜和细胞核。     

甜瓜中甜菜碱醛脱氢酶基因CmBADH的克隆及非生物胁迫下的表达分析

 以甜瓜（Cucumis melo L.）‘TS-2’为材料,根据GenBank 登录的植物甜菜碱醛脱氢酶氨基 酸保守序列设计兼并引物,利用RT-PCR 和3′、5′RACE 技术从甜瓜叶片中克隆到1 个甜菜碱醛脱氢酶基 因,命名为CmBADH,在GenBank 中的注册号为：JN091961.1。生物信息学分析表明,该基因全长1 856 bp, 编码503 个氨基酸,BADH 蛋白大小约54 kD,理论pI 为5.182。甜瓜BADH 蛋白与麻疯树同源性最高, 为82.96%。该基因编码蛋白有4 个强的跨膜螺旋结构。PlantCare 分析结果显示该基因序列具有茉莉酸甲 酯、防御与胁迫、玉米醇蛋白代谢途径、低温、光响应、分生组织表达、生理周期调控等顺式作用元件 和干旱诱导的MYB 结合位点。实时荧光定量PCR 表明,CmBADH 受盐、干旱、低温、高温诱导,其表 达均呈现先上升后下降的趋势;CmBADH 还随外源ABA 诱导时间的延长呈现上升表达的趋势。     

石斛兰dfr基因的克隆、序列分析及原核表达

二氢黄酮醇4 - 还原酶(DFR) 在不同花色形成中起着关键作用。利用RT-PCR方法从石斛兰中克隆出dfr基因, 并命名为Dendfr。该序列全长1 164 bp, 编码352个氨基酸。氨基酸序列分析发现, DenDFR与3种兰科植物的DFR氨基酸序列同源性达81% ～86% , 与其他非兰科植物的DFR氨基酸同源性在56% ～72%之间。在Den DFR N - 末端存在一个保守的NADP结合区, 序列中存在26个氨基酸组成的底物特异结合区, 其中134位氨基酸处存在特异的天冬酰胺N位点。将Dendfr的编码区克隆到pQE30载体中, 在大肠杆菌中高效表达了该蛋白, 为进一步研究石斛兰花色形成机制及花色改良基因工程打下基础。     

甜瓜CmGnT基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为了探究非生物胁迫下甜瓜N–乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的作用机制,根据甜瓜cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆得到CmGnT。生物信息学分析表明,CmGnT的cDNA全长为2 193 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸。CmGnT蛋白分子量约为46 kD,理论等电点(pI)为7.93。蛋白结构分析表明,CmGnT含有β–1,4–N–乙酰氨基葡萄糖转移酶结构域,属于糖基转移酶17家族。该基因编码的蛋白有1个强的跨膜螺旋结构。进化树分析表明,CmGnT氨基酸序列与黄瓜CsGnT(登录号:XP_004135275.1)亲缘关系最近,同源性为99.74%,与西瓜Cs Gn T的同源性为97.70%。实时荧光定量PCR分析结果表明,在NaCl、PEG、H_2O_2和ABA等非生物胁迫下的甜瓜叶片中CmGnT都显著上调表达,表明CmGnT受非生物胁迫诱导,推测其在甜瓜响09应非生物胁迫过程中起到重要作用。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

土壤未灭菌条件下丛枝菌根对枳实生苗生长和抗旱性的影响

在温室盆栽土壤未灭菌条件下,以枳实生苗[Poncirus trifoliate(L.)Raf.]为试材,研究水分胁迫下丛枝菌根真菌Glomus mosseae对其生长、可溶性糖含量、水分利用效率和制造1 g干物质用水量的影响。结果表明,在正常水分和水分胁迫条件下,丛枝菌根增加或显著增加枳实生苗的生长量,显著或极显著地提高植株的水分利用效率和叶片、根系内的可溶性糖含量,菌根和水分交互影响根系可溶性糖含量,显著降低制造1 g干物质用水量,节约用水28.4％-31.1％,增强了枳实生苗的抗旱性。     

甜瓜花器官发育相关基因的电子克隆及表达分析

以厚皮甜瓜（Cucumis melo）‘WI998’（纯雌系）与‘TopMark’（雄全同株）配制杂交组合获得的RIL₆群体为材料,对分离后代雌雄异花同株,雄全同株,完全花植株及纯雌株进行转录组测序,利用生物信息学分析方法,获得花器官发育相关基因序列Un16008,命名为CmTs2。该序列位于甜瓜第12条染色体上,长度1 842 bp,119 ~ 832之间存在一个包含237个氨基酸的最大开放式阅读框,成熟蛋白分子量为25 358.8 D,该蛋白不稳定系数为21.6,脂肪系数是99.11,平均亲水系数为0.078。通过Blast比对发现该基因与多种作物Tasselseeds2（TS2）基因具有高度同源性,其中与黄瓜Tasselseeds2基因同源性高达96%。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在甜瓜雌雄异花同株花和叶片中表达量均高于其它性别类型植株,在纯雌株中表达量最低,说明该基因可能参与甜瓜花器官发育,尤其是雌花发育的过程。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

据《园艺学报》2014年第2期《草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析》（作者张勇等）报道，以“丰香”草莓为试材进行基因克隆，并通过SON—PCR结合RT—PCR技术检测了该基因在低温胁迫和其他环境胁迫下的诱导表达特性。     

延边苹果梨PyDFR基因的克隆及表达分析

以延边苹果梨果实为试材,采用同源克隆及实时荧光定量PCR的试验方法,研究PyDFR基因在果实着色过程中的表达特性及其与花青苷积累的关系。结果表明:PyDFR基因cDNA全长1 039bp,推断其含有1个843个核苷酸的开放阅读框(ORF),编码281个氨基酸,推导的蛋白分子量为32kDa,理论等电点pI为6.32。同源性分析表明,PyDFR基因与沙梨的(JQ749637.1)DFR基因的同源性高达99%;实时荧光定量PCR分析表明,PyDFR基因受到光诱导表达量迅速上升,去袋后1d即达到最大值,随后迅速下降,最终稳定在同一表达水平,与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应,即PyDFR基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。     

草莓FaABI5基因的克隆与表达分析

以‘红颜’草莓为试材,采用同源克隆方法得到FaABI5基因,利用荧光定量PCR法获取该基因的表达模式,通过转录活性验证和亚细胞定位分析其蛋白的特性,利用大肠杆菌诱导表达该蛋白,以期为进一步解析FaABI5的基因功能提供参考依据。结果表明:草莓FaABI5基因的开放阅读框为1329bp,共编码442个氨基酸,预测分子量约为47.1kDa,理论等电点为9.70,属于不稳定亲水蛋白。氨基酸序列比对显示该基因与其它物种的ABI5蛋白具有较高一致性,系统发育树表明草莓FaABI5与森林草莓、月季中的同源蛋白聚为一支,亲缘关系较近。获得该基因起始密码子上游1500bp长的启动子序列,分析显示除了有大量ABA响应元件ABRE外,还存在许多光、植物激素及非生物胁迫响应元件。qRT-PCR结果表明,FaABI5在草莓的根和茎中表达量最高,在果实中表达量较低。在酵母中,FaABI5不具有转录激活能力。亚细胞定位试验证明FaABI5为核定位蛋白。在大肠杆菌Rosetta(DE3)中,28℃自诱导24h可以获得具有生物活性的FaABI5重组蛋白。     

桃果实PpOAT 和PpP5CS 的克隆及其对外源#br# GABA 处理的响应表达

 利用RT-PCR 结合RACE 技术从‘玉露’桃果实中克隆得到Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶 （P5CS）和鸟氨酸转氨酶（OAT）基因的全长cDNA 序列,分别命名为PpP5CS 和PpOAT（GenBank 登 录号分别为KP973954 和KP973956）。PpP5CS 全长2 511 bp,开放阅读框为2 151 bp,编码717 个氨基酸 组成的蛋白质多肽,5′-UTR 长度为123 bp,3′-UTR 序列长度为235 bp;PpOAT 全长1 686 bp,开放阅读 框1 416 bp,编码472 个氨基酸,5′-UTR 长度为151 bp,3′-UTR 序列长度为119 bp。进化树分析发现, PpOAT 和PpP5CS 与湖北海棠的同源性最高,与MhOAT 和MhP5CS 的相似性分别达到88%和91%。采 用荧光定量PCR 分析了外源5 mmol · L-1 GABA 处理对桃果实0 ℃贮藏期间果实冷害发生和内源脯氨酸 合成关键基因PpOAT 和PpP5CS 表达的影响。结果表明,GABA 处理能显著抑制‘玉露’桃果实0 ℃贮 藏期间果肉出汁率的下降,减轻冷害。通过上调果实中PpOAT 和PpP5CS 的表达,提高内源脯氨酸的合 成和积累,进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力,可能是外源GABA 处理减轻桃果实冷害的重要原因。     

大白菜耐旱相关基因BpNFYA5 的克隆及功能初步分析

 以拟南芥（Arabidopsis thaliana）NFYA5 基因（GenBank 登录号：At1g54160）的序列为基准,通过比对获得芸薹属大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Makino]同源EST 序列;采用电子克隆的方法从大白菜中克隆到相关基因全长序列,命名为BpNFYA5。该基因包含3 个内含子,其推导蛋白与拟南芥NFYA5 CCAAT-box 结合域相似性达92.6%。对大白菜进行干旱胁迫,发现BpNFYA5显著上调表达。构建了植物过表达载体pBIn-NFYA5 和RNA 干扰载体pFGC-NFYA5,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导浸花法转化拟南芥。经除草剂、潮霉素筛选及PCR 鉴定获得转基因植株。采用干旱和10% PEG6000 模拟亏水胁迫,对转基因材料的T2 代进行了耐旱性鉴定。结果显示：过表达植株（OL）较野生型植株（WT）和干扰表达植株（Ri）叶绿素含量高;渗透胁迫下OL 植株脯氨酸含量迅速积累,积累量显著高于WT 和Ri 植株;控水干旱2 周OL 株系较WT 及Ri 材料具有更好的干旱耐受性;OL 株系离体叶片的失水速率较小,叶片有效水分利用率较WT 和Ri 高。结果表明所克隆的基因BpNFYA5 在亏水胁迫调控中具有抗旱作用。     

川乌头F3′5′H 基因的cDNA 克隆与表达分析

 利用RT-PCR 结合RACE 技术,从川乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）花朵中克隆到1 个类黄酮–3′,5′–羟基化酶基因的cDNA 全长序列,全长1 720 bp,包含1 个编码506 个氨基酸的开放阅读框,命名为Ac-F3′5′H（GenBank 登录号：JN635708）。序列分析表明Ac-F3′5′H 编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括CYP 基序、I 螺旋区和血红素结合区等。氨基酸序列比对显示Ac-F3′5′H 与其它物种的F3′5′H 有很高的序列相似性。以川乌头18S rRNA 基因（FJ748878）为内参,通过半定量RT-PCR对Ac-F3′5′H 的时空表达模式进行了分析,结果显示Ac-F3′5′H 随花朵发育,表达量呈递增趋势,并且在正在开放的花朵中达到最高,而在根、茎、叶中不表达,推测该基因可能在调节川乌头蓝色花朵形成中发挥作用。     

光皮桦LFY同源基因的克隆及表达分析

以珍贵用材树种光皮桦（Betula luminifera）为材料,采用同源克隆与RACE的方法,克隆获得LFY同源基因,命名为BlLFY（GenBank号：KP970616）。BlLFY基因cDNA全长1 305 bp,开放阅读框（ORF）长1 212 bp,编码403个氨基酸。基因结构分析显示,BlLFY基因具有2个内含子和3个外显子,与其它植物同源基因具有一致的基因结构。多序列比对和系统进化分析表明,BlLFY基因编码蛋白具有典型的N-domain和C-domain,与板栗（Castanea mollissima）及核桃（Juglans regia）等木本植物的LFY具有最高的同源性和进化关系。进一步的表达模式分析结果表明,BlLFY基因在光皮桦植株进入成年期时表达水平最高,在开花植株的营养器官和生殖器官中均有表达,且贯穿雌、雄花序发育的整个过程,但在雌花序中的表达明显高于雄花序,说明BlLFY基因可能与花期转换和花器官的发育有关,但在雌、雄花序发育过程中的调控作用可能不同。     

茉莉花香气相关基因JsDXS及其启动子的克隆与表达分析

以双瓣茉莉花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,获得茉莉花香气形成限速酶即5–磷酸脱氧木酮糖合成酶（Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase,DXS）基因（命名为JsDXS）;采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列;采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在花瓣发育过程中的表达动态。结果表明,JsDXS全长cDNA 为2 505 bp,其中ORF（Open Reading Frame）为2 145 bp,编码714个氨基酸,含有TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like和Transketolase C等保守功能结构域;分离得到JsDXS基因上游调控序列745 bp,其含启动子核心元件TATA-box及T/GBOXATPIN2（茉莉酮酸酯相关元件）、CIACADIANLELHC（生物钟相关元件）、MYCCONSENSUSAT（低温相关元件）等与花香形成相关的重要顺式作用元件;荧光定量PCR分析表明,该基因在18：00时表达量较低,随着时间的推移逐渐上调,到夜间22：00时表达量达到最高,逐渐又出现下调的趋势,直至凌晨2：00时表达量降到最低,说明该基因的表达受生物钟的控制。     

结球甘蓝花粉膜联蛋白基因的克隆及其表达分析

 对结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）花粉总蛋白双向电泳及差异蛋白质谱分析, 发现膜联蛋白在花粉萌发后较萌发前表达下调。通过同源扩增和RACE 等方法首次在结球甘蓝花粉中扩增得到BoAnnexin2 基因的cDNA 序列,该基因cDNA 全长1 157 bp,开放阅读框为951 bp,编码316 个氨基酸残基,预测分子量为36.02 kD,等电点6.33。BoAnnexin2 编码蛋白C 端有4 个膜联蛋白重复序列,共2 个Ⅱ型钙结合区域,在第4 个钙结合区位点包含GXXXGXS（T）/DXXG 基序。实时荧光定量试验表明,BoAnnexin2 在甘蓝成熟未萌发花粉中的表达量是萌发45 min 后表达量的8 倍,表明BoAnnexin2 在甘蓝花粉萌发起始阶段起到重要调控作用。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。