柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5'端片段的克隆与表达分析

柳蚕(Actias selene Hübner)是鳞翅目大蚕蛾科的一种珍稀野生绢丝昆虫.利用RT-PCR方法克隆了柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5'端的一个片段,该片段序列长819 bp, 编码273个氨基酸,含有4个保守多聚丙氨酸结构域.序列比对分析表明,该片段序列与樟蚕(Saturnia japonica)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)和家蚕(Bombyx mori) 的Fib-H基因cDNA 5'端同源序列的相似性分别为72.5%、65.8%、65.1%、65.1%、47.1%.半定量PCR分析显示柳蚕Fib-H基因cDNA 5'端片段序列在5龄幼虫第1-12天的表达量呈现逐渐上升的趋势.     

柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA3′端的克隆及序列分析

柳蚕(Actias seleneHbner)是野生泌丝昆虫。从柳蚕雌蛹脂肪体中提取总RNA,根据已经解析出的其它泌丝昆虫的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物,对柳蚕卵黄原蛋白cDNA3′端进行RACE(rapid amplification ofcDNA ends)扩增,经克隆和测序得到了一条1 072 bp的cDNA片段,该序列与柞蚕(Antheraea pernyi)、天蚕(An-theraea yamamai)、野桑蚕(Bombyxmandarina)、家蚕(Bombyxmori)、樗蚕(Samia cynthia pryeri)、蓖麻蚕(Philosamiacynthia ricini)、樟蚕(Saturnia japonica)相应序列的同源性分别为82.5%、82.4%、67.0%、63.2%、80.3%、78.5%、81.0%。同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有较高的保守性。     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA 3'端的克隆及序列分析

柳蚕(Actias selene Hubner)是野生泌丝昆虫.从柳蚕雌蛹脂肪体中提取总RNA,根据已经解析出的其它泌丝昆虫的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物,对柳蚕卵黄原蛋白cDNA 3'端进行RACE(rapid ampliftcation of eDNA ends)扩增,经克隆和测序得到了一条1 072 bp的cDNA片段,该序列与柞蚕(Antheraea pernyi)、天蚕(An.theraea yamamai)、野桑蚕(Bombyx mandarina)、家蚕(Bombyx mori)、樗蚕(Samia cynthia pryeri)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)、樟蚕(Saturnia japonica)相应序列的同源性分别为82.5%、82.4%、67.0%、63.2%、80.3%、78.5%、81.0%.同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有较高的保守性.     

珍稀绢丝昆虫柳蚕的DNA条形编码与系统进化初步分析

利用DNA测序技术获得柳蚕(Actias selene)线粒体细胞色素酶C亚基Ⅰ基因(COI)5′端574 bp的片段,作为用于柳蚕种质资源分子鉴定的DNA条形编码(GenBank:FJ358505)。测定的柳蚕COI基因序列与其它大蚕蛾科绢丝昆虫的COI序列一样,均表现出偏好于碱基T的倾向(AT skew=-0.179)。在所分析的蚕类昆虫中,柳蚕与合目大蚕蛾的遗传距离最小(0.120),而与蓖麻蚕之间的遗传距离最大(0.138)。构建的NJ和UPGMA分子树中,大蚕蛾科的柳蚕属、柞蚕属、蓖麻蚕属、大乌桕蚕属、栗蚕属均各自形成一个支系,并且明显形成两个分支:大蚕蛾族(saturni-ini),包括柳蚕、柞蚕和栗蚕;眉纹大蚕蛾族(attacini),包括蓖麻蚕和大乌桕蚕。这一结果与传统分类一致。     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。     

琥珀蚕热激蛋白基因Hsp90的克隆和高低温胁迫下的表达分析

热激蛋白(heat shock protein,HSP)是生物体应对不良环境胁迫的关键蛋白,HSP90是热激蛋白家族中的重要成员。琥珀蚕(Antheraea assamensis)是一种半驯养的经济昆虫,在生长过程中常受到高低温等不利环境条件的冲击。从琥珀蚕中克隆得到AaHsp90基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:MK1656641),该序列长2 482 bp,包括126 bp的5′非编码区(5′UTR)和202 bp的3′非编码区(3′UTR),开放阅读框为2 154 bp,编码717个氨基酸,预测蛋白质分子质量为824 kD,等电点为500。AaHSP90氨基酸序列含有HSP90家族的5个特征序列及C末端的胞质保守基序MEEVD,氨基酸序列同源比对结果表明其与天蚕和柞蚕的同源序列相似度分别达到981%和990%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因mRNA在琥珀蚕卵、幼虫期各龄及5龄第4天不同组织中均有表达;相对于对照组,在高温胁迫条件下其表达量显著上调,低温刺激条件下其表达则受到抑制。研究表明AaHsp90基因在琥珀蚕对环境温度适应中起重要作用。     

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。     

柳蚕异柠檬酸脱氢酶基因cDNA的克隆与表达分析

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是生物体内一种重要的氧化还原酶。根据已报道的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)基因的保守性序列设计引物,以柳蚕(Actias seleneHubner)蛹脂肪体cDNA为模板,经PCR扩增获得了柳蚕IDH基因的部分序列。该序列长1 269 bp,编码412个氨基酸,与家蚕IDH基因的cDNA序列同源性达82.5%。柳蚕IDH与果蝇、赤拟谷盗、斑马鱼、人、大鼠、库蚊、人体虱、恶性疟原虫IDH的氨基酸序列同源性在70%左右,具有较高的保守性。半定量PCR检测结果表明,柳蚕IDH基因在蛹期不同组织中均有表达,且表达量没有显著差异。     

柞蚕NPV DNA中egt基因簇的功能性分析

通过实验得到了柞蚕NPV(Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)的双酶切的一片段,这个片段总长度为3 300bp,序列分析后确认,该序列包含NPV连锁存在的几个基因,为da16、da26、egt、lef-1、ORF13,并对其进行了分析。     

印度柞蚕（Antheraea mylitta）蛋白酶抑制因子的纯化、cDNA克隆及性质

通过硫酸铵沉淀、阴离子交换和凝胶过滤及FPLC层析从印度柞蚕(Antheraea mylitta)5龄幼虫血液中纯化得到米曲霉(Aspergillus oryzae)真菌蛋白酶抑制因子并命名为AmFPI-1。纯化的产物用双向电泳作了分析。SDS-PAGE电泳表明纯化的抑制因子分子量为10．4kDa。测出了该蛋白质N端的15个氨基酸残基序列，并依据这个序列合成了寡聚核苷酸，构建了印度柞蚕全长cDNA文库，用这些寡聚核苷酸和CDS作引物，通过PCR方法扩增了蛋白酶抑制因子的部分cDNA；用PCR扩增出的DNA作探针，筛选cDNA文库，获得了抑制因子cDNA克隆的序列。对序列分析表明：cDNA由543个核苷酸组成，包含一个315bp的ORF。编码一个105氨基酸残基的蛋白质，该序列与Bombyx mori的几个EST相似，N端氨基酸序列尤其与蜡蛾(Galleria mellonella)的诱导型丝氨酸蛋白酶抑制因子(ISPI-1)相似，表明两者存在高度的近缘关系。血液中存在的这种蛋白酶抑制因子可能在蚕体对抗微生物入侵的天然防御体系中扮演重要角色。     

白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析

白颖苔草(Carex rigescens(Franch.)V.Krecz.)的热激转录因子基因是重要的耐热候选基因。通过序列多重比对设计简并引物,扩增出白颖苔草的热击转录因子基因cDNA的中间片断,并在此基础上利用RACE技术得到3′端cDNA片段和5′端cDNA片段。结果表明:通过序列拼接获得该基因的全长cDNA(1226bp),命名为CrHSF。序列分析表明其含有一个完整的开放阅读框(103～1023bp),编码蛋白质含有306个氨基酸,分子量为38.75kDa,等电点为5.85。CrHSF的氨基酸序列与OsHSF的同源性为59%,与已知的其他热激转录因子也具有较高的同源性。在CrHSF的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域,但是具有多种翻译后修饰的加工位点。     

野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)5′端非翻译区序列的剪切方式分析

通过5′cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,克隆了野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)的cDNA 5′端非翻译区序列(5′UTR)区域,与家蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmace1)的cDNA 5′UTR(242个碱基)进行比较分析表明,Bmmace1的5′UTR包含有231个碱基,存在2个位点的点突变和一段连续11个碱基的缺失。通过克隆和测序分析野桑蚕基因组中Bmmace1的5′UTR片段,表明Bmmace1和Bmace1基因的RNA剪切都遵循GT-AG规则,但在其cDNA 5′UTR的RNA剪接过程中可能存在差异,Bmmace1在其cDNA上游+33处存在比Bmace1少剪接的序列TGATTTGAAGG,而在其基因组中5′UTR的TGATTTGAAGG序列下游-4位点缺失ACAGA序列。研究结果可为深入探讨Bmmace1基因与野桑蚕产生抗药性的关系提供基础信息。     

应用RACE技术扩增鸭A-FABP基因及序列分析

为揭示鸭A-FABP基因的结构和功能,运用RACE方法克隆并鉴定了鸭A-FABP基因的全长cDNA序列。用1对含高度保守的DNA片段的兼并引物,从鸭腹部脂肪组织总RNA扩增部分A-FABP片段,测序结果与已知序列一致;根据已知的鸭A-FABP基因序列设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。经DNASTAR中的SeqMan软件拼接5′RACE产物和3′RACE产物以及已知序列而获得片段大小为652 bp的cDNA序列。该cDNA序列由64 bp的5′非编码区、399 bp的编码序列和189 bp的3′非编码区组成。鸭A-FABP基因399 bp的开放阅读框编码132个氨基酸。经Blastn和Blastx比对分析,鸭A-FABP基因的编码区核苷酸序列与人、猪、鸡和鹅分别有76%、78%、93%和93%的同源性。     

野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析

羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

家蚕泛素结合酶新基因的克隆与基因组结构及5′调控区分析

在家蚕丝腺cDNA文库测序过程中,发现一个编码家蚕泛素结合酶的EST序列,利用3′RACE方法克隆了一个新的家蚕泛素结合酶基因cDNA全长序列,命名为BmUCE2 I(GenBank登录号为DQ219874)。家蚕BmUCE2 I基因全长cDNA由465 bp的开放阅读框序列(ORF)、97 bp的5′端非翻译区序列(5-′UTR)和237 bp的3′端非编码区序列(3-′UTR)组成,其编码的154个氨基酸与其他真核生物间具有较高的同源性。利用BmUCE2 I的EST片断作探针,通过筛选家蚕噬菌体基因组文库,获得了家蚕BmUCE2 I基因组序列和5′调控序列。BmUCE2 I基因由4个外显子和3个内含子组成,在5′端上游调控区域没有类似TATA盒元件,但在-219~-268 bp的区域存在一个50bp的启动子序列,此外还存在CF2-Ⅱ、FTZ、DFD、BRCZ2、DL、STAT、PRD-HD等多个转录因子结合位点。家蚕泛素结合酶新基因的克隆、基因结构及5′调控区的分析为进一步研究泛素蛋白水解酶复合通路相关基因的调控规律提供了重要依据。     

野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因（Bmmacel）5′端非翻译区序列的剪切方式分析

通过5′cDNA末端快速扩增（RACE）的方法,克隆了野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因（Bmmacel）的cDNA5′端非翻译区序列（5′UTR）区域,与家蚕乙酰胆碱酯酶1型基因（Bmacel）的cDNA 5′UTR（242个碱基）进行比较分析表明,Bmmacel的5′UTR包含有231个碱基,存在2个位点的点突变和一段连续11个碱基的缺失。通过克隆和测序分析野桑蚕基因组中Bmmacel的5′UTR片段,表明Bmmacel和Bmacel基因的RNA剪切都遵循GT-AG规则,但在其cDNA5′UTR的RNA剪接过程中可能存在差异,Bmmacel在其cDNA上游＋33处存在比Bmacel少剪接的序列TGATTTGAAGG,而在其基因组中5′UTR的TGATTTGAAGG序列下游-4位点缺失ACAGA序列。研究结果可为深入探讨Bmmacel基因与野桑蚕产生抗药性的关系提供基础信息。     

家蚕丝蛋白基因在不同发育时期表达量的变化

本文采用半定量RT-PCR方法,检测了家蚕4～5龄期丝腺中5个丝蛋白基因(Fib-H、Fib-L、Ser-2短片段、Ser-2长片段、Ser-3)在不同发育时期表达量的变化。结果表明,Fib-H、FIB-L及Ser-3基因的表达规律相似,总体上4龄期表达量明显低于5龄,但4龄眠期均有明显表达,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,至熟蚕或熟蚕后2d达到高峰,此后迅速下降;Ser-2基因两个转录本的表达规律基本一致,与以上3个基因相比,Ser-2基因在4龄期存在相对较高的表达量,但在4龄眠期表达量明显降低,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,Ser-2短片段和长片段分别从5龄96h和144h之后表达量开始降低,到熟蚕期基本达到最低值。     

蓖麻蚕核型多角体病毒p6.9基因的克隆及序列分析

基于丰富蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia ricininucleopolyhedrovirus,PcrNPV)分子信息的目的,对PcrNPV DNA部分片段进行了测序分析,获得1个DNA结合蛋白基因p6.9的完整序列。该基因的读码框由240个核苷酸组成,编码79个氨基酸,分子质量约为9.8 kD,转录起始位点ATG侧翼序列符合Kozak规则,其上游34bp处具有晚期基因转录的保守起始序列taag,表明该基因为晚期表达基因。将PcrNPV与12种昆虫核型多角体病毒P6.9蛋白氨基酸序列作同源性比较的结果显示:PcrNPV P6.9蛋白氨基酸序列与家蚕(Bombyx mori)NPV P6.9的同源性为59%,与柞蚕(Antheraea pernyi)NPV的同源性为100%,表明PcrNPV与ApNPV的亲缘关系很近。