鹅多杀性巴氏杆菌OmpH的扩增与生物信息学分析

为扩增鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因,预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,通过PCR扩增测序及生物信息学分析技术对该基因序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导及蛋白质二级结构的初步预测等,探讨了鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因在免疫保护中的作用。结果表明:鹅多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1537bp,ORF包含1056bp编码351个氨基酸;二级结构以无规则卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、3个糖基化位点。该研究为分析鹅多杀性巴氏杆菌外膜蛋白理化特性、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定了理论基础。     

西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析

本研究旨在分析一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性。从一株西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的全基因组测序中获得OmpH基因序列,对其核苷酸序列进行遗传进化分析,通过生物信息学软件在线对OmpH基因编码的氨基酸序列进行理论分子质量、理论等电点、亲水性和疏水性、跨膜结构、结构域、二、三级结构及抗原性分析。结果表明OmpH基因全长1 002 bp,编码333个氨基酸;遗传进化分析发现,西藏牦牛源Pm的OmpH基因与新疆牦牛源的同源性最近。OmpH蛋白的分子特性分析发现该蛋白为亲水性蛋白,较为稳定,具有信号肽结构,所有序列均在膜外,无跨膜结构,属于分泌型蛋白,在PFAM数据库中存在Porin＿1结构域及低复杂性区域;该蛋白的二、三级蛋白结构分析发现分子同源三聚体构成,其中无规则卷曲占比45.35%,结构较为稳定。抗原性分析OmpH蛋白的保护性抗原的总体预测为0.6945,高出正常阈值0.2945。OmpH具有抗原性的可能性较大,可作为免疫原性蛋白和多杀性巴氏杆菌疫苗的较佳候选抗原。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的克隆表达及抗原性鉴定

为了对禽多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白H(Omp H)的免疫学活性进行鉴定,本研究根据已发表的多杀性巴氏杆菌X-73株(U50907.1)设计了两对引物,用PCR方法扩增了禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801株的Omp H,扩增片段为1 348bp(ORF为1 056bp)。扩增的Omp H与GenBank中登录号为AE004439.1(Pm70株)、EF635422.1(C44-1株)、EU016232.1(P52株)、JQ082510.1(XJ121株)、U50907.1(X-73株)、U52200.1(P-1059株)的序列比对分析结果表明,其核苷酸同源性范围在80.2%~98.4%,氨基酸同源性范围在79.6%~98.5%。扩增了去信号肽的Omp H基因,构建原核重组表达质粒pET-Omp H,转化BL21并诱导表达,SDS-PAGE结果表明,表达蛋白约为56ku,与预期分子量的大小相符;蛋白免疫印迹试验结果表明,该蛋白具有良好的免疫学活性,为建立禽Pm血清学检测方法以及禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗的研究奠定了基础。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌ompH基因原核表达及抗原性鉴定

[目的]克隆、表达牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(ompH)并鉴定其抗原性.[方法]扩增牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的ompH基因,构建原核表达载体pET28a - ompH,转化大肠杆菌BL21( DE3)并诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达目的蛋白,利用Western blot检测该蛋白的抗原性.[结果]成功克隆、构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的pET28a - ompH原核表达载体.诱导表达蛋白约38 kDa,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原性.[结论]ompH基因的成功表达为重组OmpH蛋白的血清学检测方法的建立、多克隆抗体的制备及疫苗的研制奠定了基础.     

兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与免疫原性鉴定

[目的]研究兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与蛋白免疫原性鉴定.[方法]根据GenBank公布的多杀性巴氏杆菌序列AE004439设计引物,经PCR扩增出兔源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA基因,开放阅读框包含l 062 bp碱基,插入到pGEX-6p-1质粒,构建成功重组表达载体pGEX-dompA,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导高效表达出多杀性巴氏杆菌成熟重组外膜蛋白ompA.[结果]表达产物经SDS-PAGE分析,重组多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA分子量在63 ku,Western blot分析显示,重组蛋白能与兔抗多杀性巴氏杆菌高免血清呈现免疫反应,表明表达的重组蛋白具有较好的免疫活性.[结论]获得的重组蛋白为家兔多杀性巴氏杆菌病诊断试剂盒和疫苗的进一步研究奠定基础.     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析*

 利用信号肽分析软件SignalP v3.0,亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1.01,GPI-锚定位点软件big-PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2.0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框(ORF)最小值为78bp,最大值为7849bp,平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15～45个氨基酸之间,平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述,主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类,提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析

利用信号肽分析软件SignalP v3．0，亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1．01，GPI-锚定位点软件big—PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2．0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框（ORF）最小值为78bp，最大值为7849bp，平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15—45个氨基酸之间，平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述，主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类，提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

鹿巴氏杆菌和腐败梭菌混合感染的细菌学诊断

湖北省建始县某梅花鹿养殖场死亡4例梅花鹿,通过对病料进行细菌的分离培养,可见典型的多杀性巴氏杆菌和腐败梭菌的菌落;通过细菌生化鉴定结果为多杀性巴氏杆菌和腐败梭菌;动物接种实验复制出了多杀性巴氏杆菌和腐败梭菌相同的病变。因此,确诊为多杀性巴氏杆菌和腐败梭菌混合感染。     

湖北麻鸡多杀性巴氏杆菌的分离和PCR鉴定

从发病的湖北麻鸡中采集病料,通过细菌分离、生化鉴定,初步判定分离菌株为多杀性巴氏杆菌;应用PCR分别对病料组织和分离菌株进行检测,均能扩增出特异性的条带,PCR产物测序后经NCBIBlast分析,与多杀性巴氏杆菌同源性为99%。经过以上的试验分析,确诊为多杀性巴氏杆菌感染。     

一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因分型及rpoE基因生物信息学分析

为分析本实验室分离保存的一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和rpoE基因编码蛋白的生物特性,通过16S rDNA、特异性基因、荚膜分型、脂多糖分型、rpoE基因扩增等分子生物学和生物信息学方法对此株牦牛源多杀性巴氏杆菌进行分析.结果 表明:此株牦牛源多杀性巴氏杆菌为B∶ L2∶ST44基因型,rpoE基因和印度牛源多杀...     

全基因组预测稻瘟菌的分泌蛋白

【目的】分泌蛋白多为病原微生物与植物受体蛋白起作用的激发子和其它致病因子，深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。利用稻瘟菌基因组学研究成果，结合计算机技术和生物信息学的方法，分析其分泌蛋白组学，将有助于全面掌握其致病因子的结构与功能。【方法】利用SignalP对稻瘟菌基因库中所有ORF的N-端信号肽存在与否进行预测，再依次通过Protcomp、TMHMM、big-PI Predictor和TargetP预测程序进行验证，寻找出所有可编码信号肽的基因。【结果】对11 108个稻瘟菌的ORF进行分析，最终预测出共有1 235个ORF可编码分泌蛋白。【结论】经验证此预测方法之可靠性较高，这为深入研究分泌蛋白组学奠定了基础。     

玉米黑粉菌基因组编码蛋白作用位点的计算机预测

利用已公布的玉米黑粉病菌基因组全序列数据及信号肽预测软件SignalP v3．0、亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1．01、跨膜螺旋结构预测软件TMHMM v2．0和膜锚定位点预测软件Big-PI Predictor预测分析了玉米黑粉病菌基因组编码蛋白的作用位点。结果表明,在6522个ORF中,具有分泌功能的有543个,占全基因组基因总数的8．3％;作用位点在线粒体的有1552个,占全基因组基因总数的23．4％;具有跨膜结构的有1269个,占全基因组基因总数的19．5％;锚定在膜上的有56个,占全基因组基因总数的0．9％。     

青春双歧杆菌ATCC15703I型Sec途径分泌蛋白的预测和功能分析

[目的]对青春双歧杆菌分泌蛋白进行预测和功能分析,为分析该菌胞外蛋白的分泌机制和功能打下基础.[方法]以青春双歧杆菌代表菌株ATCC15703基因组编码蛋白序列为研究对象,采用 SignalP 4.0和TMHMM 2.0 软件分析该菌株的I型Sec途径分泌蛋白,同时采用COG功能数据库(Cluster of Orthologous Groups of proteins)对预测的这类分泌蛋白进行功能分析.[结果]青春双歧杆菌ATCC15703的1 648个蛋白中有91个被I 型(Spase I)信号肽酶识别的I型Sec途径分泌蛋白,分泌蛋白的信号肽长度最大的有54个氨基酸,最小的有11个氨基酸.I 型Sec途径分泌蛋白的功能分析结果显示,分泌蛋白主要参与碳水化合物代谢与转运,氨基酸代谢与转运,复制、重组和修复,以及无机离子代谢和转运.[结论]青春双歧杆菌I型Sec途径分泌蛋白的预测和功能分析为了解该菌胞外蛋白的分泌机制提供了数据基础.     

长双歧杆菌NCC2705分泌蛋白的全基因组预测和功能分析

以长双歧杆菌NCC2705基因组序列为研究对象,使用Signal P 4.0、Lipo P、TMHMM 2.0软件分析该基因组中的分泌蛋白及其信号肽的类型,同时采用COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)功能数据库对预测的分泌蛋白进行功能注释和聚类分析。结果表明,长双岐杆菌NCC2705中共有37个Sec途径分泌蛋白,其中Sec途径分泌蛋白包括27个被I型(SPaseⅠ)信号肽酶和10个Ⅱ型信号肽酶(Spase II)识别的蛋白,Sec途径分泌蛋白信号肽长度最多的有52个氨基酸,最少的有10个氨基酸。分泌蛋白的功能分析表明,该菌株分泌蛋白中含有大部分的假定蛋白,主要参与氨基酸代谢与转运、碳水化合物代谢转运,无机盐离子代谢转运,细胞壁和细胞膜生物合成的功能有关。     

米曲霉分泌组的预测及分析

利用信号肽分析软件SignalP3.0跨膜结构预测软件Phobius、TMHMMv2.0和THUMBUP,GPI锚定位点预测软件big-PIPredictor,亚细胞蛋白定位软件TargetP1.1,对米曲霉全基因组中的12063个氨基酸序列进行预测。在米曲霉中有1019个分泌蛋白,编码这些蛋白的ORF最小为330bp,最长为5651bp,平均为1370bp。利用LipoP1.0分析预测得到的分泌蛋白中,755个带有I型信号肽酶识别位点,25个带有Ⅱ型信号肽酶识别位点,酶切位点附近氨基酸比较保守。利用TatP1.0对1019个分泌蛋白进行分析,得到43个蛋白序列可能从Tat途径分泌,但是没有找到RR-motif。在1019个分泌蛋白中,497个有功能描述,主要包括各种酶类、能量产生与传递以及自身修复防卫等。     

应用计算机手段分析植物病原细菌Ralstonia solanacearum的蛋白质序列*

 应用SignalP 3.0，LipoP和TargetP对植物病原细菌Ralstonia solanacearum基因组中的3440个ORFs（open reading frames）进行了信号肽分析，同时系统分析了信号肽的类型及结构。结果表明，3440个ORFs中有462个ORFs所编码蛋白质具有N-端有信号肽序列，其中348个分泌类信号肽、100个信号肽具有RR-motif信号肽，14个脂蛋白类信号肽，未发现Prepilin-like 信号肽和Bacteriocin and Pheromone信号肽。在这462个具有可切割信号肽的分泌蛋白中，有84.0%蛋白质为胞外分泌型（S型），13.2%为线粒体分泌型（M型），另外有2.8%为其它类型的分泌蛋白。通过LipoP分析该菌的全基因组预测具有4种类型蛋白质，其中其中SpI有425个，占12.3%；SpII有80个，占2.3%；CYT有2541个，占73.9%；TMH有414个，占12.0%。比较了Ralstonia solanacearum和Pseudomonas syringae pv. tomato信号肽的长度及氨基酸的组成，发现这两种菌在这些方面存在这很大程度的相似性。本研究通过对Ralstonia solanacearum进行分泌蛋白和信号肽结构的分析，为将来功能基因组和分泌型外源蛋白的利用提供理论基础。     

可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback),影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛...     

亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌系统及底物蛋白分析

[目的]分析亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌装置及底物蛋白。[方法]从NCBI中选取亚硝化单胞菌is79a3菌株基因组注释的蛋白质氨基酸序列,采用Blast程序搜寻基因组中编码Sec途径分泌装置的蛋白,同时采用Signal P 4.0、Lipo P、TMHMM 2.0软件分析该菌株基因组中Sec途径的底物蛋白,同时采用COG功能数据库进行功能分析。[结果]通过分析发现亚硝化单胞菌is79a3菌株编码Sec途径分泌装置有关的蛋白15个,包含Sec途径分泌系统中12个转运蛋白编码基因,1个信号肽识别蛋白编码基因和2个信号肽酶蛋白编码基因;Sec途径底物蛋白分析结果显示366个含有Sec途径Spase I类肽酶识别的信号肽,36个蛋白只含有Spase II类肽酶识别的信号肽。402个Sec途径底物蛋白功能分析结果显示:有272个蛋白功能不清楚,130个蛋白有具体的功能注释。[结论]亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌装置完整,该菌株Sec途径底物蛋白大多数没有功能注释和功能未知,在有功能注释的蛋白中,主要参与细胞壁/细胞膜的生物合成、蛋白质翻译后修饰/蛋白更替、无机离子转运代谢、能源产生与转换。     

枯草芽孢杆菌subtilis str.168双精氨酸途径分泌蛋白预测及功能分析

[目的]对枯草芽孢杆菌subtilis str.168双精氨酸转运途径(Tat)分泌蛋白进行预测和功能分析。[方法]从NCBI中选取枯草芽孢杆菌subtilis str.168基因组注释的蛋白质氨基酸序列,然后用Signal P 4.0、Lipo P、Tat P、TMHMM 2.0软件分析该基因组中双精氨酸途径的分泌蛋白,同时采用COG功能数据库对预测的分泌蛋白进行功能注释和聚类分析。[结果]通过分析发现108个有motif没有酶切位点的Tat信号肽蛋白、25个有酶切位点没有motif的Tat信号肽蛋白、124个既有酶切位点也有motif的Tat信号肽蛋白,其中105个蛋白归为Tat途径的分泌蛋白。[结论]对枯草芽孢杆菌Tat途径分泌蛋白的基因组预测和功能分析,将为分析该菌胞外蛋白的分泌机制打下基础。