甜高粱对混合盐碱胁迫的响应及耐盐碱种质鉴定

为评价甜高粱资源对混合盐碱胁迫的耐受性,挖掘耐混合盐碱胁迫甜高粱资源,并筛选适合甜高粱芽期和苗期耐混合盐碱胁迫的鉴定指标,本研究设置4个不同浓度混合盐碱液(T1、T2、T3和T4,对应的Na+浓度分别为50、100、200、300mmol/L;对应的p H分别为7.12、8.01、8.80、10.07)对5个甜高粱品种进行胁迫处理,测定了甜高粱的相对发芽率、幼苗茎叶鲜重、叶片相对电导率、叶片脯氨酸含量、叶片过氧化物歧化酶(SOD)活性等指标,采用模糊数学隶属函数法和灰色关联分析法评价各材料耐盐性的强弱。结果显示,随着胁迫强度的增加,所有材料的相对发芽率和茎叶鲜重均呈现下降趋势,相对电导率和脯氨酸含量均呈现上升趋势,而SOD活性则表现出先升高后降低的趋势,在T3处理SOD活性达到最高值。依据T3处理的各项数据进行灰色关联分析,结果显示,5个测定指标与综合抗盐碱指数的关联度大小排序依次为脯氨酸含量(0.95)、茎叶鲜重(0.93)、相对电导率(0.92)、SOD活性(0.91)和相对发芽率(0.74)。5个材料耐盐碱适应能力强弱按隶属函数法的排序为雅津106号雅津4589号雅津2号雅津4184号雅津10号,按灰色关联分析法的排序为雅津2号雅津106号雅津4589号雅津4184号雅津10号。以上结果表明,5份甜高粱种质对混合盐碱胁迫的耐受性存在显著差异,茎叶鲜重、脯氨酸含量、相对电导率和SOD活性是评价甜高粱耐盐碱胁迫性的关键指标,雅津106号的抗盐碱能力最强,雅津10号的抗盐碱能力最弱。     

西伯利亚蓼PsLEA基因的克隆及在NaHCO_3胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼叶片cDNA文库中获得的胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)基因的部分序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA),命名为PsLEA(GenBank登录号:FJ478172)。该基因全长686bp,5'非翻译区为102bp,3'非翻译区为131bp,开放读码框为453bp,编码150个氨基酸。荧光定量PCR分析表明:正常情况下PsLEA基因在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中皆有表达,其中茎中表达量最高。3%NaHCO3诱导胁迫下,叶、茎、地下茎中PsLEA表达均受到影响且表达模式存在差异,说明PsLEA基因与西伯利亚蓼的耐盐性相关。     

异源过表达Atvip1基因增强转基因高粱对盐碱胁迫的抗性

为了研究异源过表达Atvip1基因的高粱对盐碱胁迫的耐受性及相应生长情况,采用NaHCO_3∶Na_2CO_(3 )为5∶1,75 mmol/L,pH值9.63的盐碱胁迫液在高粱三叶一心期处理,在胁迫0,4,12,24,72,120 h对根系的生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及MDA含量进行测定。结果表明:异源过表达Atvip1基因能缓解盐碱胁迫对高粱幼苗生长的伤害,可使幼苗根表面积和根体积增大,根尖数和分叉数增多,高粱主根褐化出现较晚且症状轻,侧根发生早且数量多,在72 h后仍能保证新叶正常伸展,对地上部生长影响较轻。过表达Atvip1基因可提高转基因高粱根系抗O_2~(-·)活力,降低MDA的含量,抗氧化酶活性增强;胁迫早期(4～12 h),SOD、CAT和GR作用明显;胁迫中期(24～72 h),所有酶均发挥作用;胁迫后期(120 h),CAT和GSH-PX起重要作用。盐碱胁迫差异转录组分析中,差异表达基因COG分析表明,防御机制在不同时间段中占比较大,获得抗氧化酶相关差异表达基因42个。异源过表达Atvip1基因可通过缓解盐碱胁迫对光合作用和生长发育的影响,降低活性氧破坏及膜损伤来提高转基因高粱对盐碱胁迫的抗性。     

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp (GenBank登录号AY970822)和1 037 bp (GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA (GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA (GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blotting分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。     

混合盐碱胁迫对谷子萌发、幼芽生长的影响及耐盐碱品种筛选

探索了谷子萌发、生长对混合盐碱胁迫的反应,初步筛选耐盐碱材料,旨在为谷子耐盐碱机制研究和耐盐碱新品种培育提供基础材料和依据。结果表明:浓度≥60mmol/L盐碱胁迫下,谷子种子发芽率较对照显著降低;芽长、根长、发芽指数、活力指数大体均随着盐碱浓度的增大而减小,浓度≥60mmol/L盐碱胁迫下与对照差异达到极显著水平,且品种间各指标差异较大;谷子芽期耐盐碱性鉴定的适宜浓度为60~100mmol/L。从20份谷子材料中初步筛选出苗期耐盐碱材料3个,中耐材料6个,敏感材料8个,高度敏感材料3个。耐盐碱的9324-8-3、坝谷214和晋谷23号3份材料中9324-8-3耐盐碱程度最高,盐碱害指数为22.38%。     

盐碱胁迫下羊草消减文库的构建及分析

以盐碱胁迫下的羊草地上部分cDNA为实验方(tester),非盐碱条件下生长的羊草地上部分cDNA为消减方(driver),利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了盐碱胁迫下羊草消减文库.从消减文库中筛选1920个阳性克隆,PCR鉴定插入片段大部分集中在300～800 bp之间.将聚类后得到的552个非重复序列与GenBank中的序列进行比对,其中有548条与数据库中的序列有同源性,其中功能已知的339个,功能未知序列209条.获得了与盐碱胁迫相关的基因,如单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)、铁蛋白(Ferrtin)、水孔蛋白(PIP)、脱水素基因(dehydrin)、14-3-3蛋白等.本实验为抗逆基因的克隆及系统研究盐碱胁迫下羊草相关基因的表达奠定了基础.     

2种向日葵杂交种的抗盐碱性鉴定

为探讨不同盐碱胁迫下向日葵的耐盐碱性,选取2个向日葵品种(JK 1406、晋葵11号)为研究对象,研究了2种向日葵种子在盐碱胁迫下幼苗生长和生理特性的情况。结果表明:低浓度的盐碱胁迫一定程度能促进种子萌发;随着胁迫浓度的增加,种子的发芽率和发芽指数显著下降,并在高浓度盐碱胁迫下,JK 1406的SOD有小幅增加。在种子萌发期,2种向日葵对低浓度的盐碱均有一定抗性,但JK 1406较晋葵11号有更强的耐盐碱性。     

盐碱胁迫下外源H2O2对毛白杨生理特性的影响

研究外源H2O2对盐碱胁迫下毛白杨生理特性的影响规律,为提高毛白杨盐碱地造林效果提供理论依据.在盆栽条件下,设置营养液(对照,H1)、营养液+NaHCO3+NaCl(H2)、营养液+NaHCO3+NaCl+H2O2(H3)、营养液+H2O2(H4)4个处理,3次重复.结果 表明,H2与H1相比显著提高了毛白杨超氧阴离子...     

盐碱胁迫下棉花幼苗对外源褪黑素的生理响应

新疆土壤盐碱化严重影响棉花种子的萌发及幼苗生长,本试验通过分析外源褪黑素对盐碱胁迫下棉花幼苗生长指标的影响,了解褪黑素对盐碱胁迫下棉花幼苗的调控效应;通过盆栽试验,分析了盐碱胁迫下喷施外源褪黑素对棉花幼苗生长、抗氧化酶活性及有机酸含量的影响。结果发现,在盐碱胁迫下,棉花幼苗的生长受到了抑制,过氧化氢与丙二醛含量显著增加,过氧化氢酶、超氧化物酶活性降低,有机酸含量提高。在盐碱胁迫下,施用外源褪黑素可缓解棉花幼苗的盐碱毒害症状,增加植株生物量。SOD、CAT的活性显著提高,H2O2与MDA的积累减少,从而减轻了盐碱胁迫对棉花的损害,提高了棉花苗期对盐碱胁迫的耐受性。     

青花菜BoPGIP1基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析

为进一步验证青花菜Bo PGIPl基因的功能,通过RT-PCR方法克隆得到青花菜Bo PGIP1基因完整的编码区序列,将其克隆到原核表达载体p ET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达Bo PGIP1基因的重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1),重组菌经IPTG诱导表达以及SDS-PAGE电泳检测,结果表明,在37 k Da处有一条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致;同时对重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1)的抗逆性进行分析,结果表明,BL21(p ET28a-Bo PGIP1)对Na Cl(0.4 mol/L)、Na HCO3(0.2 mol/L)和PEG6000(20%)的抗性明显高于对照菌株BL21(p ET28a),该抗性的证明为Bo PGIP1基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了理论依据。     

蓖麻RcHSF基因家族鉴定与冷胁迫下的表达模式分析

为明确蓖麻HSF基因家族的结构特征与冷胁迫下的表达模式,利用序列比对法实现蓖麻HSF基因家族成员的全基因组鉴定,通过生物信息学手段对基因家族成员的序列结构、理化性质、染色体定位、启动子顺式作用元件、蛋白保守结构域、系统进化关系以及聚类方式进行分析,并结合RNA-Seq与qRT-PCR对RcHSFs的表达水平进行验证。结果表明,蓖麻基因组中含有19个RcHSF基因家族成员;基因分析发现RcHSFs分别含有1～3个外显子,定位在17个染色体片段上且呈不均匀分布,其中大多数RcHSFs均含有AAGAA-motif、MYB与MYC元件,暗示其响应植物激素与逆境胁迫;蛋白分析表明,RcHSFs按照基序类型与排布方式被聚为A、B、C 3类,推测不同类型HSF的蛋白功能存在差异,尽管所有成员均存在不同程度的motif缺失,但结构域高度保守;RNA-Seq分析发现仅RcHSF4与RcHSF10受冷胁迫诱导表达,与qRT-PCR验证结果一致。结果为RcHSFs基因的克隆与功能研究提供重要的理论基础,为蓖麻抗冷新种质资源的建立提供候选基因。     

梭梭热激因子家族基因HaHsfA5的鉴定及其在高温胁迫记忆中的表达

植物能够对经历过的高温胁迫产生"胁迫记忆",从而更好地适应反复发生的高温胁迫。鉴定梭梭热激因子基因HaHsfA5序列和结构特征,分析其在梭梭幼苗高温胁迫记忆中的表达规律,对梭梭高温胁迫适应性研究有重要理论价值。本研究内容包括:以反转录PCR克隆HaHsfA5读码框全长序列;以在线生物信息学工具预测HaHsfA5的蛋白理化参数、蛋白结构域和基元;进行HaHsfA5的序列比对和进化树分析;以qRT-PCR分析HaHsfA5在高温胁迫记忆中的表达。生物信息分析显示HaHsfA5为分子量较小、不稳定、亲水的HSFs家族A亚族蛋白,与甜菜、菠菜、藜麦的Hsf A5有较近亲缘关系。qRT-PCR分析显示经过高温胁迫锻炼的梭梭幼苗在高温胁迫处理下HaHsfA5表达显著上调,而正常条件下生长的梭梭幼苗在高温胁迫处理下其表达并未显著上调。综合Ha HsfA5的结构特征和表达规律,提示HaHsfA5功能可能与梭梭幼苗的高温胁迫记忆有关。本研究为进一步分析Ha Hsf A5在梭梭幼苗高温胁迫记忆中的功能提供研究基础,对梭梭耐高温品系选育和耐逆机制研究可能具有推动作用。     

逆境下水稻(Oryza sativa L.)rHsp90基因的克隆及功能分析

本研究中,利用差异显示法,在碳酸盐逆境下,从水稻(OryzasativaL.)根的cDNA文库中克隆得到了水稻热激蛋白90基因(rHsp90,GenBankAccessionNo.AB037681)。Northern杂交结果表明,在水稻根中,rHsp90基因的转录水平在包括盐(NaCl,NaHCO3和Na2CO3),PEG,高pH(pH8.0和pH11.0)以及热激(50℃)逆境下,都受到了不同程度的诱导。同时,适量表达rHsp90基因的酵母(Saccharomycescerevisiae)在各种盐逆境以及热激逆境中,生长状态要好于对照。对转水稻rHsp90基因烟草的抗盐(NaCl,NaHCO3)分析表明,转基因烟草的生长势要好于野生型烟草。通过以上研究表明,水稻rHsp90基因与逆境之间具有一定的应答关系,并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。     

蓖麻CNGC基因家族鉴定与冷胁迫下的表达模式分析

环核苷酸门控通道蛋白(cyclic nucleotide-gated channel proteins,CNGCs)是介导低价阳离子转运的重要蛋白,在植物信号传递、生长发育与非生物胁迫响应等方面发挥重要作用.本研究利用序列比对法在蓖麻基因组水平进行CNGC家族成员鉴定;利用生物信息学手段对蓖麻CNGC家族成员的基因结构、保守基序、特征结构域、聚类方式、顺式作用元件及染色体定位信息进行分析.研究成功鉴定到17个蓖麻CNGC基因家族成员,定位于16个未完整拼接的染色体片段上;除RcCNGC13外,其他蛋白序列均包含高度保守的环核苷酸结合结构域CNBD,但RcCNGC4RcCNGC6RcCNGC13RcCNGC14均存在明显的基序缺失;部分RcCNGCs启动子区均含有MYB、MYC与ABRE、ARE元件,推测其响应逆境胁迫.聚类分析将蓖麻CNGC成员分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,推测不同类型CNGC蛋白存在功能差异.转录组数据分析发现仅有RcCNGC14受冷胁迫显著上调表达,暗示该基因参与调控蓖麻的冷适应性.本研究首次在蓖麻全基因组水平对CNGC基因家族进行鉴定,并分析其冷胁迫下的表达模式,为进一步创制蓖麻抗冷新种质提供重要的候选基因.     

甘蔗CIPK23基因克隆及对低钾、干旱、盐胁迫的响应

本研究采用RT-PCR技术从低钾胁迫的甘蔗根系中克隆得到一个长度为1 749 bp的与CBL互作的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,命名为Ss CIPK23(Gen Bank登录号为KM981737),包含1 350 bp的开放阅读框(ORF),可编码一个449氨基酸残基的多肽。Ss CIPK23具有CIPK基因家族典型的蛋白激酶结构域和NAF调控结构域。进化树分析显示Ss CIPK23与其他作物的CIPK23关系较近,具有较高的保守性。q PCR分析结果表明,在低钾、干旱和盐胁迫下,Ss CIPK23的表达都发生改变。在低钾胁迫24 h后Ss CIPK23相对表达量开始上升,而且随着胁迫时间的延长,相对表达量持续增加;而在干旱和盐胁迫下,相对表达量最高出现在48 h,随后表达量开始下降,暗示了该基因在低钾、干旱和盐胁迫下发挥重要的调控作用,可为深入研究Ss CIPK23基因功能奠定坚实的基础。     

蝴蝶兰一个C3型PEPC基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

为研究蝴蝶兰对低温胁迫响应的分子调控机理,本研究采用RT-PCR及RACE的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个C3型PEPC基因PhPEPC (登录号为:MK482383),该基因cDNA全长序列为3 448 bp,开放阅读框长度为2 898 bp,编码965个氨基酸;该蛋白包含一个PEPC酶结构域,具有2个PEPCase活性位点,86个磷酸化位点和7种motifs,为一酸性亲水性蛋白。系统进化分析显示,蝴蝶兰PhPEPC蛋白与兰科植物小兰屿蝴蝶兰、铁皮石斛、深圳拟兰等的PEPC蛋白亲缘关系最近。分析表明,PhPEPC基因在蝴蝶兰根中表达水平最高,在花器官中的表达水平次之,在叶和花梗中的表达水平最低;在13℃/8℃的昼/夜温度条件下,PhPEPC基因的表达水平先升高后降低,当恢复培养3 d时,该基因的表达水平又趋于升高。结果表明,蝴蝶兰PhPEPC基因参与了对低温胁迫的调控。本研究结果将有助于理解蝴蝶兰对低温胁迫的适应机制,并为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供依据。     

一个新的水稻逆境响应基因OsMsr1的表达与克隆

为深入了解植物的逆境反应机理和发现新的水稻耐逆基因, 采用Affymetrix水稻表达芯片(含51 279个转录本)分析了超级稻两优培九母本培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平, 筛选出众多表达水平显著升高与降低的基因。OsMsr1 (Oryza sativa L. multiple stresses responsive gene 1, GenBank登录号为EU284112) 是其中一个受高温、低温与干旱诱导、在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因, 用实时定量PCR方法对其表达水平进行了进一步的分析, 所得结果与基因芯片结果基本吻合, 因此, 此基因为一多逆境响应基因。用RT-PCR方法扩增获得了包含其完整ORF (open reading frame)的cDNA克隆。根据其ORF序列进行预测, 此基因编码一个包含89个氨基酸残基的小分子蛋白, 分子量约为10 kD, pI约为5。搜索有关数据库, 在水稻、玉米、小麦与拟南芥中找到有高相似性的基因, 但功能未知, 也未发现相同与类似的已知功能的基因保守结构域。对其可能的启动子序列分析, 发现5个与逆境反应有关的顺式作用元件。因此, 我们认为该基因为一新的水稻耐逆候选基因, 进一步的研究正在进行。     

紫花苜蓿(Medicago sativa)YABBY基因家族的生物信息学分析及其对逆境胁迫的响应

YABBY转录因子家族是植物特有转录因子,与植物形态有关,在植物响应胁迫方面也有重要的调控作用。为了研究YABBY基因家族在苜蓿抗逆性中的作用,本研究利用生物信息学对苜蓿的YABBY转录因子家族成员、分布及结构等进行分析。对苜蓿、大豆、水稻和拟南芥进行系统进化树的分析,表明该家族基因在植物中具有同源性。理化性质和结构分析表明,苜蓿中YABBY基因主要分布在第2、4、5条染色体上,苜蓿YABBY家族基因中包含5个保守结构域,其蛋白质主要以无规则卷曲的形式构成,α-螺旋、β-折叠和β-转角含量较少,启动子序列分析发现该家族存在ABRE顺式反应元件,能够响应盐胁迫及ABA(Ascisic acid)胁迫,通过基因表达模式分析,发现MsYABBY2基因响应盐、碱、干旱等逆境胁迫,推测其在抗逆境胁迫中起到关键调节作用。本研究为后续研究MsYABBY基因的抗逆机制及调控机理提供了理论基础。