鹅源副粘病毒NA-1株F蛋白基因的克隆及其载体的构建

鹅源副粘病毒分离株 NA- 1经 1 1日龄鸡胚增殖后收集尿囊液 ,浓缩 ,提取病毒基因组总 RNA,采用 RT- PCR方法 ,一次性扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯回收后克隆入 p MD1 8- T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,对阳性克隆进行了序列测定和序列分析。测序后拼接的 F基因长 1 6 72 bp,包含完整的开放阅读框 ( 1 6 6 2bp) ,编码 5 5 3个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 R- R- Q- K- R- F1 1 7,与 NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。根据 NDV基因分型标准 ,鹅源副粘病毒 NA- 1株归属基因 型 NDV。将 F基因克隆入转座载体 p Fast Bac ,得到重组转座载体 PFF,将 PFF转化大肠杆菌 DH1 0 Bac,提取质粒 ,得到阳性重组穿梭载体 re- Bacm id,为下一步的转染表达奠定了基础     

血清Ⅰ型鸭源副粘病毒HN蛋白基因的遗传变异及原核表达

参考GenBank发表的鹅副粘病毒（GPMV）SF02株基因组核苷酸序列，设计并合成了1对特异性引物，采用RT—PCR技术扩增鸭源血清I型禽副粘病毒DP1／0z株的HN基因，并进行遗传变异及原核表达研究。结果显示，HN基因共1716bp，编码571个氨基酸，存在6个潜在的糖基化位点和13个完全保守的半胱氨酸（C）残基。与GenBank中收录的鹕源副粘病毒HN基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为81．3％～98．3％和87．2％～98．4％，系统进化树分析表明DP／02株与鹅源副粘病毒处于同一进化分支。经SDS—PAGE、Western—blot分析，原核表达的HN蛋白相对分子质量在63000左右，1mol／L（终浓度）IPTG时间梯度诱导，3h时HN蛋白表达量最高，占整个菌体蛋白含量的30％，且能与鼠抗鸭源血清I型禽副粘病毒阳性血清反应。     

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。     

NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。     

来自5种动物禽Ⅰ型副粘病毒HN基因的序列分析

本研究对从广西5种不同动物体内分离到的禽Ⅰ型副粘病毒毒株,进行了HN基因的扩增、克隆和序列分析.5个APMV-Ⅰ分离株HN基因的核苷酸序列同源性为94.7％～98.4％,推导氨基酸序列同源性为96.3％～99％,同源性较高;5个毒株的HN基因与国内广东、山东、福建等地的当前流行株同源性较高,但与经典毒株同源性较低;遗传分析表明HN基因相对保守,都源于同一个基因亚群.     

禽副粘病毒-2型标准毒株与不同分离株HN基因的序列测定及分析

提取实验室保存禽副粘病毒-2标准毒株Yucaipa株和3株分离毒株F4、F6、F8株的RNA，经RT—PCR，获得4株毒株的HN基因，同时测得F基因与HN基因之间的序列。序列分析结果表明，HN基因的ORF全长为1743 nt，编码一个由580个氨基酸组成的蛋白。运用DNAMAN软件分析，4株毒株与GenBank上已发表毒株的HN基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性相比，同源率分别为99．89％和99．69％。分析F基因与HN基因间序列发现两基因间序列与副粘病毒科其他病毒的基因间序列相似，含有基因起始信号和终止信号，但不含3个碱基的连接序列。通过序列分析，在分子水平上进一步证实分离于同一批进口七彩文鸟的F4、F6株是抗原性存在差异的两个毒株。毒株间的血清学关系与分子水平的核苷酸序列、氨基酸序列的比较关系一致。     

鹅源I型禽副粘病毒JG97株F基因的分子特性分析

根据GenBank中鸡新城疫病毒（NDV）基因序列合成了1对引物,通过RT-PCR扩增出了鹅源I型禽副粘病毒（AMPV-1）或NDV JG97株的F基因。将扩增片段克隆到pGEM-T载体中,并进行了序列测定。该片段含1个完整的、长1662bp的F基因开放阅读框（ORF）,编码的F蛋白长553个氨基酸,其中含有12个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸顺序为^112R-R-Q-K-R-F^117,与NDV强毒株特征相符。同源性分析表明,JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97株的核苷酸和蛋白氨基酸的同源性分别为94．6％-99．6％和96．6％-99．5％,与LaSota株的核苷酸和氨基酸的同源性仅为84．6％和88,8％。结果表明JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97等5个毒株的遗传关系较近,而与LaSota株差异较大。     

鹅源副粘病毒的分离与鉴定

从鹅全中分离到一株副粘病毒，该病毒能使SPF鸡胚100%死亡，试验证实该病毒颗粒呈多形性，有囊膜，直径260mm左右；ELD50为10^9.6/mL；通过动物接种试验，发现该病毒对鹅具有100%的发病率和致死率，而且对鸽，鸡也具有较高发病率和致死率。     

鹅副粘病毒YG97分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株YG97经10日龄鸡胚增殖后纯化，提取病毒的基因组RNA，采用RT－PCR一次性扩增出与预期设计的1.9kb大小相符合的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R-T载体，经转化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，进一步进行了序列测定。序列分析表明所扩增的病毒的HN基因片段的长度为198bp，共编码571个氨基酸。同源性分析表明，YG97与LaSota毒株核苷酸同源性为79％，氨基酸的同源性为87％。与台湾1995年分离株Taiwan/95核苷酸和氨基酸的同源性分别为93％、96％，说明YG97与Taiwan/95亲缘关系较近，具有较高的相似性。与国内外部分发表的其它NDV毒株的核苷酸同源性在80％－84％之间，氨基酸的同源性在87％－91％之间。同源性分析表明YG97相对于经典的NDV在HN基因上发生了较大的变异。     

麻鸡副黏病毒ZH-1株HN基因真核表达载体的构建及其免疫试验

应用RT-PCR方法从麻鸡副黏病毒ZH-1株中扩增HN基因并克隆人pGEM-T载体,经序列测定、分析,结果显示ZH-1株HN基因与NDV国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到92％.将HN基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-HN,转染Vero细胞,能在Vero细胞中表达,利用pCI-HN质粒进行动物试验,结果表明,雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,pCI-HN质粒二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为67％,这一结果提示,利用HN基因构建的核酸疫苗具有重要的开发应用价值.     

鹅细小病毒主要免疫原性蛋白VP3基因遗传变异及其原核表达

根据鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计并合成了1对特异性引物,采用PCR技术对GPV GD-01株的VP3基因进行扩增,将目的基因克隆到pGEM(R)-T后测序,分析了GPV GD-01株VP3基因的遗传变异情况,并进行原核表达.结果表明,GPV GD-01株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸(DQ665790),与已发表的GPV、番鸭细小病毒(MDPV)的核苷酸、氨基酸同源性分别为96.15%、80.1%,97.78%、89.13%,说明GPV VP3基因具有较高的遗传稳定性.结合亲水性、表面极性、抗原位点分析比较GPV、MDPV VP3基因,为研究GPV和MDPV感染谱差异的分子机制提供了一定的理论基础.原核表达显示,VP3蛋白的最高表达量占整个菌体蛋白含量的29.9%,经表达条件优化可产生大量可溶性VP3表达蛋白.SDS-PAGE与Western-blot分析显示,表达的VP3蛋白的相对分子质量约60000,并能与鼠抗GPV阳性血清反应,证明具有一定的反应原性,为进一步研制基因工程疫苗及诊断制品奠定了基础.     

鹅副粘病毒病的研究进展

鹅副粘病毒病是近年来引起各种年龄鹅发病并致死的一种烈性传染病。目前，本病在我国许多省市流行，具有很高的发病率和死亡率。本文从临床症状、病理变化、病毒的组织嗜性、生物学特性和分子生物学性状等方面对鹅副粘病毒病作一综述。     

新城疫病毒地方分离株HN基因的克隆及遗传变异分析

对河北省保定地区两个NDV分离株用RT-PCR技术扩增其HN基因片断,产物经转化、克隆和测序,参照国内外已发表新城疫代表株绘制NDV系统发育进化树并分析其遗传关系,结果表明,两个分离株HN基因在遗传上同源性高达99.7%,两个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为82.8%～93.2%,推导氨基酸序列同源性为90.0%～96.0%,由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系.     

JS/1/97/Go株GPMV NP基因的克隆、序列分析

根据GenBank中发表的GPMV SF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1470bp大小相符的片断,将此扩增产物克隆入PMD18-T载体,进行序列测定和分析.结果表明:所扩增的NP基因的核苷酸长为1 470bp,共编码490个氨基酸.同源性分析表明:JS/1/97/Go与国内的SF02株的NP基因核苷酸同源性为98.6%,氨基酸同源性为99.6%.由此可见,鹅副粘病毒JS/1/97/Go分离株与SF02株的亲缘关系较近,同属于新城疫Ⅶ型基因.而其与LaSota株的核苷酸同源性为85.2%,氨基酸同源性为90.8%.说明该毒株相对于经典的NDV在NP基因上已发生了较大的变异.     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.