中国东北地区3株日本脑炎病毒株的分离鉴定及基因分型

从黑龙江省某3个猪场采集疑似为日本脑炎病毒感染的病、死猪的脏器以及全血,进行病毒的细胞培养,蚀斑纯化,间接免疫荧光试验,电镜下观察病毒粒子的形态,及RT—PCR检测。结果显示,盲传三代后,出现明显的细胞病变（CPE＋～CPE＋＋＋）;荧光显微镜下细胞胞质内呈现不同强度的绿色荧光信号;电镜下的病毒粒子为40-60nm的球型粒子;PCR检测为日本脑炎病毒阳性。通过对3株分离株腑扩增序列比较,此3株分离株为基因Ⅲ型。     

猪圆环病毒2型陕西株的分离鉴定

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的序列,设计2对PCR引物,对疑似PCV2感染猪的血液、肺脏和淋巴结等病料进行套式PCR扩增检测,并对PCR检测为PCV2阳性的病料进行PCV2分离与鉴定。结果显示,PCV2在PK-15细胞上生长良好,但增殖较慢且不产生细胞病变;在第12代细胞培养物中用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR扩增反应均能检测到PCV2,且特异性很强。表明试验分离的病毒为PCV2。     

广西猪乙型脑炎病毒的分离及初步鉴定

【目的】了解广西猪乙型脑炎（JE）地方流行毒株特点,为有效防控广西猪JE奠定基础。【方法】对从广西各地猪场采集疑似JE病例猪的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎、公猪精液、猪舍蚊子等靶组织样品进行猪乙型脑炎病毒（JEV）检测,并选择部分阳性样品进行JEV分离鉴定及病毒E基因遗传进化分析。【结果】在采集的465份JE疑似病料样品中,有72份为JEV阳性;通过接种BHK-21细胞、乳鼠及SPF鸡胚,分离获得两株JEV地方分离毒株,分别命名为GP株和LC株;遗传进化分析显示,GP株和LC株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%和99.8%;两株分离株与疫苗毒株SA14-14-2的核苷酸同源性分别为99.7%和99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.6%,且均属G III型JEV。【结论】广西受检猪群存在较严重的JEV感染,应引起重视并加强防控。     

广西猪乙型脑炎病毒的分离及初步鉴定

【目的】了解广西猪乙型脑炎（JE）地方流行毒株特点,为有效防控广西猪JE奠定基础。【方法】对从广西各地猪场采集疑似JE病例猪的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎、公猪精液、猪舍蚊子等靶组织样品进行猪乙型脑炎病毒（JEV）检测,并选择部分阳性样品进行JEV分离鉴定及病毒E基因遗传进化分析。【结果】在采集的465份JE疑似病料样品中,有72份为JEV阳性;通过接种BHK-21细胞、乳鼠及SPF鸡胚,分离获得两株JEV地方分离毒株,分别命名为GP株和LC株;遗传进化分析显示,GP株和LC株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%和99.8%;两株分离株与疫苗毒株SA14-14-2的核苷酸同源性分别为99.7%和99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.6%,且均属GIII型JEV。【结论】广西受检猪群存在较严重的JEV感染,应引起重视并加强防控。     

猪圆环病毒2型江西樟树株的分离与鉴定

对江西省樟树市某猪场疑似PCV2感染猪的血液、肺脏和淋巴结等病料进行PCR扩增检测,将PCR检测为PCV2阳性的病料进行PCV2病毒的分离,并将分离纯化的PCV2病毒接种试验猪,获取感染PCV2的试验猪的相关脏器进行荧光定量PCR和免疫组化检测。结果表明:利用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR方法可以确定PCV2的存在。利用荧光定量PCR和免疫组化可以检测到人工感染PCV2的试验猪相关脏器有PCV2病毒的存在。     

日本脑炎病毒WHe株NS1基因的克隆、测序及表达

以日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)WHe株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术,克隆了JEV WHe株的NS1基因,并对其进行了测序和序列分析。构建了pET28b-NS1表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),并对其进行了诱导表达,对表达产物进行检测。结果表明,NS1基因全长1 145 bp,其核酸序列与JEV P3株同源性为99．4％,与SA14和SA14-14-2等27个JEV毒株的核苷酸序列同源性为98％,表明NS1基因的保守性很高;pET28b-NS1表达产物的相对分子质量约为43 ku,大小与预期结果相符。NS1基因克隆表达成功。     

日本乙型脑炎病毒分离株E基因的克隆及序列分析

[目的]对日本乙型脑炎病毒分离株E基因进行克隆及序列分析。[方法]根据乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株序列,设计并合成一对E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV分离株E基因片段,将其与pMD19-T载体连接,应用DNAStar、Clustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较。[结果]分离株E基因的cDNA长1 500 bp,可编码500个氨基酸;分离株E基因与VN50/Viet Nam/1989/Hu-man brain株、SA14株、Whe株、Benjing 1株、P3株、KV1889株J、aGAr01株和SA14-14-2株的核苷酸同源性为88.0%～99.1%,氨基酸同源性为97.8%～99.8%;分离株为乙型脑炎病毒强毒株。[结论]该研究为乙脑病毒基因工程疫苗的研发奠定了一定的基础。     

猪流行性腹泻病毒GD-A株的分离鉴定及S基因序列分析

【目的】在广东省某疑似发生猪流行性腹泻的猪场中,采集病猪的粪便样品,经RT-PCR检测阳性的样品接种于Vero细胞,以分离猪流行性腹泻病毒.【方法】通过在细胞上的连续传代,直至能稳定增殖.并通过RT-PCR对细胞培养物进行特异性片段的检测,观察细胞病变(CPE)的发生情况,以及间接免疫荧光(IFA)检测猪流行性腹泻病毒的M蛋白,对病毒进行分离与鉴定.【结果和结论】病毒在盲传5代时能观察到典型病变,传至20代时能在Vero细胞上增殖稳定.RT-PCR、CPE与IFA的结果证明,所分离到的病毒为PEDV,并命名为GD-A株.     

传染性法氏囊病毒HN株的分离鉴定及应用免疫荧光检测IBDV

河南郑州地区某养鸡场的三黄肉鸡出现精神沉郁,拉水样白色粪便,剖检可见法氏囊水肿、出血;肾脏出血肿大,有尿酸盐沉淀,呈花斑状;腿肌、胸肌有出血斑点;腺胃与肌胃交界处出血。经病毒分离、鸡胚接种、琼脂扩散试验和细胞接种试验,最后确诊为传染性法氏囊病。同时,采集病料,制备冰冻切片,建立一种检测病料中的IBDV免疫荧光检测方法。     

鸡传染性支气管炎病毒豫北株的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定鸡传染性支气管炎病毒。[方法]从豫北某蛋鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集气管分泌物、肾脏等组织分离病毒,进行血凝试验、NDV干扰试验,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对HN07的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定。[结果]结果表明,分离到1株病毒,经连续鸡胚传代后,出现侏儒胚和蜷缩胚;血凝试验中,尿囊液无血凝性,而经胰酶处理后有血凝性;NDV干扰试验中,分离的尿囊液明显干扰NDV的增殖;病毒回归试验中病毒可引发接种鸡37.5%死亡;RT-PCR检测试验中,扩增到了约为1.7 kb的目的片段。DNAstar软件分析表明,测定基因具有IBVS1基因的共有分子特征,而且分离株HN07和HD株S1的同源性最高,核苷酸同源性为93.6%。[结论]分离的病毒株HN07为鸡传染性支气管炎病毒。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株的分离鉴定及序列分析

【目的】分离鉴定乙型脑炎病毒(JEV),确定分离毒株的基因分型及其E区段氨基酸的序列特征。【方法】采用BHK-21细胞培养法,从猪脑组织标本中分离出1株病毒,对其进行细胞和免疫荧光试验,同时采用RT-PCR扩增并克隆该毒株的PrM、E区段核苷酸序列,利用PrM(456~695位)区核苷酸序列与36株参考序列进行基因分型分析,并对E区核苷酸序列与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的相应序列进行比对,分析分离株和疫苗株氨基酸的同源性及关键结构域的差异。【结果】分离出的病毒经细胞病变和直接免疫荧光试验证实为乙脑病毒,命名为SX-BJ07;用该病毒感染BHK-21细胞,72 h后所有细胞均发生病变(CPE);用该病毒接种3日龄乳鼠,72 h之内即可导致乳鼠死亡;SXBJ07株PrM(456~695位)区基因分型证实,分离株属于基因Ⅰ型,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的同源性分别为87.7%和97.0%,但在E蛋白的活性关键结构域有13个氨基酸存在差异。【结论】从陕西省境内首次成功分离到1株Ⅰ型乙脑病毒,初步确定了该分离株的分子特征,对乙型脑炎的流行病学研究及其防治具有重要意义。     

HRP-SPA ELISA检测猪日本乙型脑炎病毒抗体的研究

将盐析法提纯的、用Hela细胞系增殖的猪日本乙型脑炎病毒JapaneseBencephalitis(JEV)抗原包被酶标板,以HRP-SPA作为第二抗体,建立了检测JEV抗体的ELISA试验方法。结果表明,抗原的最适包被浓度为1∶800,待检血清最适稀释度为1∶50,HRP-SPA最佳工作浓度为1∶1000,各步反应时间确定为5min。交叉试验、阻断试验、重复性试验、敏感性试验证明本实验特异性强,重复性好,敏感性高。包被的病毒抗原经甲醛固定15min即可进行正式试验。确定其测定标准为:S/N≥14.81为阳性,S/N<12.53为阴性,12.53≤S/N<14.81为可疑。     

日本脑炎病毒WHe株全长cDNA的长链RT-PCR法的扩增

为深入探索日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)WHe株的致病机理,并为新型疫苗研发提供技术支持,采用长链RT-PCR技术对其基因组全长cDNA进行了扩增鉴定,并对含复杂二级结构的3′末端和5′末端非编码区扩增片段进行了测序分析。扩增结果表明,扩增出的JEV WHe株基因组全长cDNA分子近11 kb大小;非编码区测序分析表明,扩增产物为WHe株所特有。提示长链RT-PCR法可用于JEV WHe株基因组全长cD-NA的扩增。     

乙型脑炎血清学诊断方法研究进展

猪乙型脑炎的诊断在实验室是简单方便的,但是在我国的广大农村由于受到器材、人员的限制,诊断比较困难.针对这种情况,提出了Dot-ELISA检测法、斑点金免疫渗滤法和SPA协同凝集等几种简单方便快捷的在农村有极大潜力的血清学诊断方法.     

羊口疮病毒新疆流行株的分离鉴定及其遗传进化分析

【目的】研究羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法,检测、分离和鉴定ORFV毒株,对分离鉴定的3株ORFV毒株保护性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。【结果】从病料中分离鉴定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析结果显示,ORFV分离株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守,B2L和F1L基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为88.6%~97.9%和86.7%~97.4%;3个毒力基因的变异相对较大,尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为91.8%~97.3%,85.2%~97.0%和71.5%~98.5%。基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明,ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分离株均与台湾分离株的亲缘关系最近。【结论】试验分离的ORFV新疆流行株可能是由台湾株与其他毒株重组后产生的,且其毒力基因发生了较大的变异。     

猪瘟病毒与猪流行性乙型脑炎病毒复合RT-PCR检测方法的建立

猪瘟病毒(CSFV)和流行性乙型脑炎病毒(JEV)是引起种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提.根据CSFV的E2基因保守序列和JEV的E基因保守序列,选取 2 对引物建立检测CSFV、JEV的复合RT-PCR方法,分别扩增出了大小为 508 和1 015 bp 特异性基因片段.应用此方法检测了10份临床样品(淋巴结、脾、肝、肺等组织),结果4份CSFV阳性,3份JEV阳性,其余为阴性.结果表明此CSFV 和 JEV 复合RT-PCR 诊断方法,具有很好的特异性和敏感性,可用于临床检测.     

我国华东某省HP-PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】从我国华东地区某省3个不同市县的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料中分离PRRSV毒株,并对其全基因组进行测序,进而对当前PRRSV流行毒株的分子特征和近几年我国PRRSV毒株的演化特点进行分析。【方法】采集养殖场病死猪的淋巴结和肺脏病料,处理后进行PRRSV的RT-PCR检测。对PRRSV检测呈阳性的病料进行病原分离和免疫荧光试验(IFA)鉴定,测定IFA鉴定呈阳性的PRRSV分离株的TCID50。参照NCBI基因数据库已提交的PRRSVVR-2332、CH-1a、HB-2及JXA1等毒株序列设计6对引物,对所得分离毒株分别进行全基因组序列扩增、测序,并将测序结果与LV、VR-2332、JXA1等国内外16个PRRSV毒株进行序列同源性和进化分析。【结果】试验共分离鉴定获得3株PRRSV毒株,分别命名为SDCXA/2008、SDWF、SDLY。全基因组Blast比对结果表明,这3个分离株均为北美洲型毒株。序列分析发现,3个分离株的全基因组序列与欧洲株的同源性极低(61.6%～61.8%),与2006年前分离的美洲型毒株的同源性较低(86.6%～97.1%),与2006后分离的美洲型毒株同源性较高(98.3%～99.7%)。Nsp2基因在3个易变区中变异最大,ORF5次之,ORF3相对最小;推导氨基酸序列中变异最大的亦为Nsp2。3株PRRSV毒株Nsp2基因推导氨基酸的第481和532～560位处共存在30个氨基酸缺失,与以HUN4、JXA1等为代表的国内高致病性分离株序列的同源性较高,结合进化分析将其均划为与JXA1类似的高致病性猪蓝耳病毒株(HP-PRRSV)。【结论】分离到3株HP-PRRSV毒株,其遗传特征相对稳定,但同时也发生了一定的变异,说明PRRSV还在不断地变异和演化。PRRSV的分布无明显地域性。