猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在杆状病毒中的表达

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株S基因5′端含有B、C抗原位点的片段。将该片段亚克隆至杆状病毒转移载体pMelBac B中。重组质粒经纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经4轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组病毒,最终实现了在昆虫细胞内的蛋白表达。经Dot-ELISA进行抗原性分析,结果表明重组蛋白具有抗原性。本研究猪传染性胃肠炎血清学诊断方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。     

猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白C抗原位点的原核表达研究

为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的血清学检测方法的建立提供必要的诊断抗原,通过基因重组的方法,在大肠杆菌表达系统中表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)spike蛋白C抗原位点。Western blot试验表明:表达的重组蛋白具有良好的抗原性。研究为TGEV血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白C和D抗原位点在大肠杆菌中的串联表达

使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白C和D抗原位点多肽基因序列。依次将C和D抗原位点多肽基因序列克隆至表达载体p ET-32a中。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。结果显示,在分子量25 k Da处有1条明显的蛋白表达条带,且能被TGEV阳性血清识别。本研究为TGEV的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在巴斯德毕赤酵母KM71中的表达

猪传染性胃肠炎(TGE)是猪的一种急性、高度接触性传染病,各种年龄及品种的猪对本病均易感,其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100％.该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).TGEV S蛋白(或称E2蛋白)形成病毒粒子表面的突起,携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇.S蛋白含有4个抗原位点,从氨基末端开始依次定为C、B、D和A,4个抗原位点都位于S蛋白N端543个氨基酸残基之内[1-2].本试验在巴斯德毕赤酵母KM71中表达了TGEV S蛋白B、C抗原位点片段,为建立TGE血清学检测方法提供必要的物质基础.     

毕赤酵母分泌表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点的高密度发酵

本研究首先通过摇瓶培养方法,确定了表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白B和C抗原位点片段的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方为甘油45 g/L、氨水单次补加量0.12%、甲醇流加量1.00%。然后采用分批补料培养方法对毕赤酵母GS115/pPIC9-TY进行高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为60.18 mg/L。本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,为下一步大规模化制备重组蛋白奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点片段的真核表达

为探讨利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因疫苗的可行性,构建了以奶牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白为报告基因的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因抗原位点区乳腺表达载体pEGBS。通过脂质体介导方法将其转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,在倒置荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光分布于阳性细胞,并且RT-PCR检测结果显示,RT-PCR扩增产物与目的基因片段大小相符,证明其确实源于重组质粒转录后的mRNA。     

猪传染性胃肠炎病毒S1基因在食品级乳酸菌中的表达

猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)纤突蛋白S携带主要的B淋巴细胞抗原表位,是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白,本试验通过PCR扩增,获得TGEV S蛋白上约1 218bp的保护性抗原基因S1,将其克隆到pMD18-T载体并进行核酸序列测定。通过双酶切连接成功获得重组质粒pNZ8149-S1,电转化至乳酸乳球菌NZ3900中,经乳链菌肽诱导,SDS-PAGE和Western-Blot分析结果显示,TGEV S1基因获得了表达,表达产物具有反应原性。间接免疫荧光试验结果表明,重组乳酸菌表达的蛋白位于菌体表面。     

猪传染性胃肠炎S基因A D抗原位点在昆虫杆状病毒系统中的表达

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为主要临床症状的高度接触性传染病。该病对2周龄以内的仔猪具有高度致病性，致死率高达100％，是威胁养猪业发展的重要传染病。     

多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒

为了检测、区分猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)，建立了同时检测这2种疾病痛原体的多重PCR方法。参考GenBank登录的TGEV和PEDV纤突蛋白S基因序列，经DNAsis 2．0比较分析。分别筛选出TGEV、PEDVS基因相对保守区。以TGEV TH-98株(GenBank登陆号为AF494337)和PEDV CV777株(GenBank登陆号为NC003436)为参考模板，利用软件Primer3设计合成了2对寡核苷酸引物，以ST细胞培养的TGEV和PEDV毒株核酸为模板。利用所设计的2对引物进行多重RT-PCR扩增，结果同时得到与试验设计相符的499bp(TGEV)和199bp(PEDV)的扩增条带。而对其他3种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明。建立的多重RT-PCR方法可检测出10pgTGEV RNA和100pg PEDV RNA。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建

参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白的二级结构和B细胞抗原表位的预测

以TGEV基因组序列为基础,运用Garnier—Robson、Chou—fasman和Karplus—Schulz方法预测猪传染性胃肠炎病毒N蛋白的二级结构。运用Kyte—Doolitte方法对N蛋白的疏水性进行了分析,Jameson-Wolf方法预测了结构蛋白的抗原指数,Emini方法预测了N蛋白的表面可能性,最后结合吴玉章的方法综合分析预测B细胞抗原表住。结果显示柔性区域主要集中在N-端第11～31、52～65、128～147、155～188、210～227、313～319、331～347区段,α-螺旋和β-折叠数量少且分散。N蛋白可能的B细胞抗原位点是N-端12～31,154～191,204～243,309～320,329～354区段,而这些区段内部或附近都有柔性区域存在,可作为N蛋白的抗原优势表位。本研究为TGEV抗原优势表位的试验研究和反向疫苗的研制奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒NSP5蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NSP5蛋白的单抗隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达并纯化的重组NSP5蛋白(r NSP5-GST)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛出一株稳定分泌抗TGEV NSP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(5C3)。MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶6 400和1∶105。Western blot鉴定表明该MAb能够识别原核及真核表达的NSP5重组蛋白。利用肽扫描法鉴定显示,该MAb识别的抗原表位为286EFTPTEVIR QMYGVN300。本研究制备的MAb及其抗原表位的鉴定,为TGEV NSP5蛋白结构和功能的研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白抗原表位区的表达及其免疫原性分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白(S)上主要抗原位点的免疫原性,本研究将S基因上A、B、C、D四个位点进行RT-PCR扩增,构建重组质粒pET30a-S,诱导表达后Western-blot检测,表明目的蛋白具有良好的抗原性。将纯化的目的蛋白免疫小鼠3次,在初次免疫后第0,14,28,42天采血,并用间接ELISA方法监测血清抗体动态水平变化。结果表明,获得的重组蛋白能诱导免疫小鼠产生特异性的体液免疫,说明该蛋白具有发展成TGEV亚单位疫苗的潜力。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位区基因克隆、分析及原核表达

从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,Western blotting鉴定,结果表明该抗原表位区蛋白得到了重组表达.该研究可为PEDV抗原表位区的相关研究提供参考.     

狐源犬瘟热病毒F蛋白B细胞抗原表位基因的克隆表达

为了研究犬瘟热病毒的抗原表位区段,试验以犬瘟热病毒基因组序列为材料,根据预测的F蛋白N端含有抗原指数较高的区域,选择可能含有潜在的B淋巴细胞优势抗原表位的片段,将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上进行B淋巴细胞抗原表位基因的克隆表达。结果表明:该区段能够在原核载体上高效表达。     

SARS-CoV S蛋白抗原表位富集区的表达与初步应用

扩增并克隆编码SARS-CoV S蛋白中包含多个抗原表位的第539～630氨基酸残基区域的基因片段。基因片段经酶切处理后插入表达载体pGEX-6p-1的BamHⅠ和XhoⅠ位点之间,构建成融合表达质粒,转化宿主菌BL21经IPTG诱导后融合基因得到了表达,表达产物可用谷胱甘肽sepharose 4B RediPack亲和层析柱纯化。用5份SARS患者康复期血清对表达融合蛋白进行ELISA和免疫印迹试验,分析融合蛋白的免疫反应性,结果表明重组融合抗原在ELISA和免疫印迹试验中与5份SARS患者康复期血清均具有良好的免疫反应性。试验结果提示该SARS-CoV S蛋白第539～630氨基酸残基区域可作为SARS的诊断抗原。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白多表位抗原免疫原性分析

在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株CV777毒株S基因基础上,选取S抗原优势表位EP(499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa和1368～1374 aa)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因,优化后通过编码柔性连接肽(G...     

猪传染性胃肠炎病毒NSP8蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的初步鉴定

为鉴定猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)NSP8蛋白的抗原表位,本研究对GST-NSP8重组蛋白进行了原核表达,并用纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏,采用常规杂交瘤细胞融合方法,经3次亚克隆后制备了1株稳定分泌抗NSP8蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。分泌的单克隆抗体亚类鉴定其重链为IgG1型,轻链为κ链;杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶3 200。Western blotting试验结果表明该单克隆抗体能识别原核及真核表达的NSP8重组蛋白。利用截短表达的方法对NSP8蛋白进行抗原表位的鉴定,初步确定了单克隆抗体针对的抗原表位序列为31SPQILKQLTKAFNIAKSDFEREASV55。本研究制备的单克隆抗体及对抗原表位的鉴定,为TGEV NSP8蛋白相关功能的研究奠定了基础。