猪传染性胃肠炎病毒血清抗体Dot-ELISA检测方法的建立

为快速检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)抗体,本研究以原核表达系统串联表达的含有TGEV S蛋白抗原表位C的重组蛋白r-(C_1C_2)6为包被抗原建立TGEV血清抗体的Dot-ELISA检测方法。经反应条件优化结果显示,抗原最适包被量为62.5 ng/点;血清最佳工作浓度和工作时间分别为1∶80和45 min;羊抗猪IgG-HRP最佳工作浓度和工作时间分别为1∶800和45 min;最适封闭条件分别为5%脱脂乳37℃,45 min;血清和酶标抗体最适反应温度均为37℃;最佳显色时间7.5 min。结果显示该方法与猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒阳性血清无交叉反应,表明其具有良好的特异性。该方法对TGEV阳性血清最低检测限为1∶1 280。采用建立的Dot-ELISA对27份临床猪血清样品进行检测,结果显示Dot-ELISA与TGEV/PRCV抗体检测试剂盒检测结果的符合率为92.6%。本研究建立的Dot-ELISA检测方法简便、快速、灵敏、特异,适合用于TGE快速诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原表位C的串联表达研究

为比较含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗原表位C不同表位密度的重组蛋白的抗原性,本研究将抗原表位C的编码核酸序列进行串联,构建了重组表达质粒pET-(C_1C_2)_2~p ET-(C_1C_2)_6,并在原核表达系统中表达了重组蛋白。Western blot分析表明,表达的6种重组蛋白r-C_1C_2~r-(C_1C_2)_6均具有良好的抗原性。采用Dot-ELISA方法对各重组蛋白进行了抗原性比较分析。结果表明,含有12个表位肽的重组蛋白r-(C_1C_2)_6的抗原性强于其它重组蛋白。本研究制备的串联重组蛋白为建立TGE血清学诊断方法奠定了物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的C和D线性抗原表位的抗原性比较

为比较猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白含有的两个线性抗原表位(C和D)的抗原性,本研究采用Dot-ELISA方法对原核表达的S蛋白抗原C和D的两种线性表位重组蛋白进行了抗原性比较分析。结果表明,在等质量或等摩尔的条件下,含有抗原线性表位C的重组蛋白的抗原性弱于含有抗原线性表位D的重组蛋白。本研究为建立TGEV感染的血清学诊断方法,以及进一步研究抗原线性表位C和D的结构及功能奠定了基础。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

TGEV S基因原核表达及表达蛋白间接ELISA方法的建立与初步应用

为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。     

猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白C抗原位点的原核表达研究

为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的血清学检测方法的建立提供必要的诊断抗原,通过基因重组的方法,在大肠杆菌表达系统中表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)spike蛋白C抗原位点。Western blot试验表明:表达的重组蛋白具有良好的抗原性。研究为TGEV血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在杆状病毒中的表达

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株S基因5′端含有B、C抗原位点的片段。将该片段亚克隆至杆状病毒转移载体pMelBac B中。重组质粒经纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经4轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组病毒,最终实现了在昆虫细胞内的蛋白表达。经Dot-ELISA进行抗原性分析,结果表明重组蛋白具有抗原性。本研究猪传染性胃肠炎血清学诊断方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在巴斯德毕赤酵母KM71中的表达

猪传染性胃肠炎(TGE)是猪的一种急性、高度接触性传染病,各种年龄及品种的猪对本病均易感,其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100％.该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).TGEV S蛋白(或称E2蛋白)形成病毒粒子表面的突起,携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇.S蛋白含有4个抗原位点,从氨基末端开始依次定为C、B、D和A,4个抗原位点都位于S蛋白N端543个氨基酸残基之内[1-2].本试验在巴斯德毕赤酵母KM71中表达了TGEV S蛋白B、C抗原位点片段,为建立TGE血清学检测方法提供必要的物质基础.     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白抗原表位区的表达及其免疫原性分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白(S)上主要抗原位点的免疫原性,本研究将S基因上A、B、C、D四个位点进行RT-PCR扩增,构建重组质粒pET30a-S,诱导表达后Western-blot检测,表明目的蛋白具有良好的抗原性。将纯化的目的蛋白免疫小鼠3次,在初次免疫后第0,14,28,42天采血,并用间接ELISA方法监测血清抗体动态水平变化。结果表明,获得的重组蛋白能诱导免疫小鼠产生特异性的体液免疫,说明该蛋白具有发展成TGEV亚单位疫苗的潜力。     

微小隐孢子虫P23基因在毕赤酵母中的表达及初步应用

为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。     

猪沙波病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

以原核表达重组蛋白作为抗原建立了猪沙波病毒(SaV)抗体的间接ELISA检测方法。使用矩阵滴定法确定抗原包被浓度为6.4μg/mL,血清稀释倍数为1∶50。试验选用1%BSA作为封闭液,血清和二抗的最佳作用时间分别为60 min和40 min。选择无致癌的TMB为底物,确定TMB最佳反应时间为10 min。通过对20份猪阴性血清样品的检测,计算阳性判定值为0.203。通过交叉试验、批内和批间重复性试验证明,本研究建立的SaV间接ELISA检测方法具有特异性高,重复性好的特点,可用于猪沙波病毒抗体的检测。     

猪流行性腹泻病毒荧光抗体的制备及应用

本研究旨在建立一种可辅助猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离鉴定的直接荧光抗体检测方法。借助基因工程技术融合表达PEDVS1基因中和抗原表位区域(COE),层析柱法纯化兔源免疫球蛋白IgG,搅拌法标记荧光素。通过Western blotting和动物免疫试验测定表达融合蛋白的抗原性,间接ELISA方法测定免疫后的抗体效价,直接免疫荧光法测定标记荧光抗体的特异性,梯度稀释方法测定标记抗体的最佳工作浓度。结果显示,本研究成功将423bp的S1基因中和抗原表位COE进行融合表达,表达蛋白大小约40ku,蛋白命名为pGEX-6P/COE;Western blotting检测结果表明,融合蛋白具有良好的反应原性;ELISA检测结果显示,免疫后35d的血清抗体效价达1∶25 600;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)及猪细小病毒(PPV)等均无非特异性反应,标记的荧光抗体具有良好的特异性,最佳工作稀释度为1∶32~1∶64。综上所述,本试验制备的直接免疫荧光抗体可用于细胞平台上的PEDV快速检测,能直观地提供相关检测数据,对于病毒分离过程的取舍具有重要指导意义。     

猪传染性胃肠炎病毒重组核蛋白的纯化与Dot—ELISA抗体检测方法的建立

将重组猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因原核表达载体p^ProEXHTb转化的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达核蛋白，经过Ni-NTA柱的纯化，获得纯化核蛋白。以该蛋白制备抗原，建立了以TGEV N蛋白重组抗原的Dot-ELISA诊断技术，其抗原最适包被量为1μg，抗原预点膜在4℃可保存5周以上。本法快速简便，适合基层进行抗体检测。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立

试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

猪β-防御素1在毕赤酵母中的串联表达

猪β-防御素1(pBD1)是在猪体内广泛分布的一种抗菌肽,在猪的先天免疫系统中发挥重要的作用。本试验为实现pBD1在巴斯德毕赤酵母中的高效表达,根据pBD1基因的成熟肽序列和巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性,设计合成pBD1三倍串联体(3pBD1)基因序列,将合成的目的基因克隆到表达载体pHLI-S1中,构建重组表达载体pHLI-S1-3pBD1,线性化后的pHLI-S1-3pBD1电转化至毕赤酵母宿主菌GS115,PCR鉴定阳性转化子,MM平板和MD平板鉴定Mut表型。将鉴定为阳性的Mut~+型重组酵母菌株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析表达上清液。结果显示,获得的重组酵母菌株为Mut~+表型,经甲醇诱导表达后,表达上清液中含有分子量为22 kDa的目的蛋白。结果表明,获得了能够表达3pBD1的重组巴斯德毕赤酵母。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

为了获得在体外表达的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,研究其免疫原性,试验根据GenBank公布的国内PCV2-Cap蛋白基因序列特点,结合毕赤酵母密码子偏好对Cap基因进行优化,合成目的基因后,构建分泌型表达载体pPIC9K-Cap,转化毕赤酵母GS115后,经诱导表达获得重组Cap蛋白。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后检测抗体水平。结果表明:含有PCV2-Cap基因的质粒成功转化到酵母菌基因组中,重组酵母菌株在30℃,经1%甲醇诱导表达96 h后,培养液中能够检测到33 ku的重组蛋白,重组蛋白表达量为155μg/mL,占培养上清液总蛋白的9.362%,Western-blot试验结果显示重组蛋白具有良好的抗原活性。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后,能够刺激豚鼠产生特异性抗体且与接种0.3头份/只剂量的市售PCV2灭活疫苗产生的抗体水平无显著差异(P0.05)。说明成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2-Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原活性。     

猪流行腹泻病毒N蛋白表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪流行性腹泻病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因序列,RT-PCR扩增了长约1 300 bp的N基因片段,连接pET30a表达载体后获得了以可溶性形式表达的重组N蛋白.重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性.以该蛋白作为诊断抗原,建立检测PEDV抗体的PPA-ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和PEDV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因在昆虫细胞中的表达

为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ原核表达和抗原性分析

为分析猪乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白Ⅲ结构域的抗原性,本研究克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的E蛋白结构域Ⅲ,并通过pET-28a载体进行融合表达和纯化。用纯化后蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,通过SDS-PAGE、Western blotting、间接ELISA及间接免疫荧光方法(IFA)检测小鼠及猪抗体滴度,验证E蛋白结构域Ⅲ的抗原性。SDS-PAGE结果表明融合蛋白以包涵体形式表达;Western blotting、间接ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性;纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠ELISA方法检测特异性抗体滴度可达1×10⁵;猪JEV阳性血清ELISA抗体滴度可达5.1×10⁴;IFA结果表明JEV E Ⅲ蛋白产生的抗血清能很好的识别乙型脑炎病毒抗原。以上结果表明,表达、纯化的重组JEV E Ⅲ蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为建立以E蛋白结构域为抗原的诊断方法提供了重要依据。