禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

禽流感病毒神经氨酸酶的研究进展

神经氨酸酶是禽流感病毒的两种表面糖蛋白之一,是一种由AIV基因组第6节段编码的Ⅱ型糖蛋白。宿主细胞膜上的唾液酸（SA．又名神经氨酸）是流感病毒的主要受体。流感病毒与宿主细胞膜上SA受体结合后,才能进入细胞。而神经氨酸酶可以降解AⅣ识别的宿主细胞膜上的受体,抑制病毒进入细胞。神经氨酸酶的这一独特功能特点使其成为国内外抗禽流感病毒研究的热点之一,同时也为制备抗禽流感转基因家禽提供了理论依据。本文简要综述了禽流感病毒的背景知识,着重介绍了神经氨酸酶的结构与功能以及目前国内外神经氨酸酶的研究状况,并对其今后的研究和应用进行展望。     

禽流感病毒神经氨酸酶的结构及其生物学功能

高致病性禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种急性传染病。AIV呈球形,有囊膜。其表面主要有2种糖蛋白,即血凝素和神经氨酸酶。其中神经氨酸酶具有重要功能,其对病毒的释放及病毒在感染细胞周围的扩散能力有很大影响。此外,神经氨酸酶对其周围的血凝素切割能力也有很大影响,从而在一定程度上可以导致病毒致病性的不同。神经氨酸酶是AIV中另一种重要抗原,抗神经氨酸酶的抗体可为机体遭受流感病毒攻击提供一定的保护力。因此,神经氨酸酶对AIV的生物学特性具有重要意义。     

H5N1亚型禽流感病毒HA、NA基因在杆状病毒中的重组体的构建

本实验将禽流感病毒的HA,NA基因克隆到转移载体Pfastbackdual中,然后使其转入到杆状病毒,经卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性及蓝白斑筛选得到阳性克隆,转染昆虫细胞,获得一株重组病毒。本研究为该病毒的亚单位疫苗的进一步研究奠定了基础。     

禽流感病毒N3亚型神经氨酸酶基因的克隆

本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOLL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT-PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18-T载体上,并进行鉴定和序列测定.测定结果表明所获得的NA基因DNA片段长1451bp,编码469个氨基酸残基,与其他亚型的NA基因编码的氨基酸长度相一致.根据推导的氨基酸序列进行预测,该蛋白具有6个潜在的糖基化位点和19个半胱氨酸残基.与其他亚型的NA基因相比较发现克隆的NA基因符合神经氨酸的分子结构特征,本研究首次获得N3亚型NA基因全序列.     

H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列设计,合成克隆引物。自H9N2亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增NA基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NA,分子量约54·7ku。经免疫印迹及ELISA分析重组NA的免疫反应性和免疫动物分析其免疫原性,结果表明:重组NA能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免疫动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。     

禽流感病毒N4亚型神经氨酸酶基因的克隆和序列分析

应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒 A/ Turkey/ Ontario/ 6 118/ 6 8(H8N4 )毒株 ,Tri Zol L S Reagent提取病毒 RNA,RT- PCR扩增神经氨酸酶 (NA)基因全片段 ,克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了鉴定和序列测定。所获得的 NA基因片段长 14 4 1bp,编码 4 90个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列进行预测 ,有 9个潜在的糖基化位点和2 0个半胱氨酸残基     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

华东地区家鸭中N2亚型低致病性禽流感病毒神经氨酸酶基因的重排

为研究华东地区家鸭中低致病性禽流感病毒NA基因的遗传进化规律,对2000年～2006年分离的包括H3N2,H5N2,H6N2,H9N2和H11N2的44株禽流感病毒的NA基因进行了遗传进化分析.44株病毒NA基因之间的同源性为82.9%～99.9%,4株H9N2病毒的NA基因同源性为96.9%～99.9%,所有H3N2病毒的NA基因同源性为92.3%～99.9%,H5N2、H6N2和H11N2病毒的同种亚型毒株间的NA基因同源性变化幅度较大,相反,有些不同HA亚型毒株间的NA基因同源性反而很高.进一步分析NA基因推导的氨基酸序列也表现出相似的规律.华东地区家鸭中N2亚型的禽流感病毒正处于不断地进化状态中,不同N2亚型的禽流感病毒之间已存在NA基因的重排.     

禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

H7亚型禽流感病毒HA基因在杆状病毒系统中的表达

利用PCR反应，以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中，转座DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆，然后提取基因组Bacmid，转染Sf9昆虫细胞，得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞，细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实，密码子优化的H7HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达，且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-THA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因，将扩增到的HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移栽体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞，经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒，用其感染Sf9昆虫细胞，并优化表达条件。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物的分子质量约为27ku。Dot-ELISA分析表明，表达的HA2融合蛋白可与鸡抗HgN2亚型血清发生特异性反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

HSN1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建

经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫原性评估

本研究以细胞感染-转染技术构建了一株表达H7亚型禽流感病毒(AⅣ)血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒rFPV-HA.以5×105PFU的rFPV-HA经翅下刺种免疫8周龄SPF鸡,免疫后第3周用100 CID5o的HA基因同源AⅣ A/Arfi St/eng-Q/983/79(H7N1)进行人工感染,1周后采集泄殖腔棉拭子进行病毒分离.免疫后第三周及攻毒后第1、2周对所有动物进行静脉采血,检测血凝抑制(HI)抗体和免疫沉淀(AGP)抗体.结果,攻毒前部分rFPV-HA免疫鸡可检测到HI抗体,但检测不到AGP抗体,野生型病毒(F017)接种组和空白对照组HI抗体和AGP抗体均为阴性.攻毒后rFPV-HA免疫组的HI抗体上升速度明显高于野生型病毒接种组和空白对照组.rFPV-HA免疫组有6/8的鸡为流感病毒分离阴性,野生型病毒接种组和空白对照组的试验鸡病毒分离全部为阳性.结果表明rFPV-HA可诱导鸡产生有效的免疫保护反应,阻止或降低消化道病毒排泄.rFPV-HA的成功构建为研制开发H7亚型禽流感活载体疫苗奠定了良好的基础.