鸡传染性贫血病LAMP检测方法的建立

本文借助环介导等温扩增技术,建立了鸡传染性贫血病的快速检测方法。通过提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,成功扩增出梯形条带。结果表明,LAMP能检测出最低DNA量约为0.245pg/μl,而PCR能检测出最低DNA量约为2.45pg/μl;且具有特异性,对其他相关鸡病病原检测结果均为阴性。用建立的LAMP方法对临床样品进行检测,同时与PCR方法比较,结果表明LAMP检测的阳性率要比PCR高。LAMP检测方法无需昂贵设备,适用于鸡场的临床快速诊断。     

鸡传染性喉气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种快速简单检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法,根据已发表的鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因序列,设计并合成了6对特异扩增鸡传染性喉气管炎病毒TK基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对鸡传染性喉气管炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,并对采集的鸡临床样品的DNA分别进行了检测。结果表明,该法只检出鸡传染性喉气管炎病毒。敏感性扩增结果表明,LAMP检测鸡传染性喉气管炎病毒的最低浓度为100 fg的DNA模板。该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对鸡传染性喉气管炎病毒的快速检测。     

2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立

本文借助环介导等温扩增技术(LAMP),建立了两种常见鸡免疫抑制病的(鸡传染性贫血病、J亚群白血病)的快速检测方法。采用简易法提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,成功扩增出梯形条带,并且对反应体系进行优化,以及特异性试验和灵敏度试验。结果表明LAMP的灵敏度可达10个拷贝,比PCR灵敏度高10倍;且具有特异性,对其他相关鸡病病原检测结果均为阴性。用建立的LAMP方法对临床样品进行检测,同时与PCR方法比较,结果表明LAMP结果基本与PCR相符,但检测的阳性率要比PCR高。操作简便,无需昂贵设备,适用于临床快速诊断。     

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。     

鸡传染性贫血

鸡传染性贫血(Chicken Infectious Anaemia,CIA)或称鸡贫血因子(Chicken Anaemia Ageat,CAA)为病毒引起的雏鸡再生性障碍贫血和全身淋巴组织萎缩的传染病,是继传染性法氏囊病后又一种免疫抑制病,为近十来年发现的几种新病之一。自1979年日本学者Yuasa等首次报导以来,德国、瑞典、丹麦、波兰、美国、英国、澳大利亚、巴西等国相继报道,1992年我国已分离到病毒。哈尔滨兽医研究所对大连、沈阳、哈尔滨的一些鸡场进行血清学调查,阳性率达81.09％。由于CIAV主要经卵垂直传     

用核酸探针检测鸡传染性贫血病毒

用核酸探针检测鸡传染性贫血病毒许兰菊王丽李慧张书松（河南农业大学牧医工程学院，郑州４５０００２）鸡传染性贫血病（ＣＩＡ）是由鸡贫血病毒（ＣＡＶ）引起雏鸡再生障碍性贫血的一种免疫抑制性疾病。病鸡全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血，有较高的死亡率，该病又称...     

鸡传染性贫血

鸡传染性贫血(chichen infections anaenia)历史上有出血综合征、贫血症一真皮炎、兰翅病等名称,此病最早由日本学者Yuasa在1979年发现,并且分离到此病毒分离物,这种传染性贫血因子(CAA)对鸡的成淋巴样细胞系及成造血细胞系有致病作用.CAA感染只限于鸡,且有日龄的抵抗力,1周龄内的雏鸡最易感,2～4周龄以后鸡的易感性明显下降,6周龄以后往往呈隐性感染经过,但是到了老年期,鸡又表现出对CAA易感,这是由于老年鸡的抗体生产能力下降的原故.     

鸡传染性贫血的诊断方法

笔者参考国内外最新有关文献资料，对鸡传染性贫血的诊断方法进行了较系统地介绍。鸡传染性贫血是由鸡传染性贫血病毒引起的以侵害雏鸡造血组织和免疫器官为主的一种传病病，近年来，国内外许多禽病工作者对ＣＩＡ的病原学、流行病学、病理学、防制措施尤其是诊断技术先进等进行了大量的实验研究，取得了可喜的时展，现将目前诊断ＣＩＡ的主要方法简述如下。     

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立

为建立一种能快速检测肠炎沙门菌(SE)的方法,本研究根据基因库中SE种特异性基因(sdfⅠ)的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了SE的LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达100fg DNA,高于常规PCR方法100倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其他常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于SE感染的快速检测。     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×10¹拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性.用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析.     

鸡毒支原体LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种鸡毒支原体(MG)的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG的基因保守序列,设计1套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应条件,建立了MG LAMP的可视化检测方法。该方法的敏感性可达10 fg/μL,高于常规PCR方法100倍;其特异性好,对其他的鸡常见病原体的检测结果均为阴性。MG LAMP反应只需一个可控温的水浴锅,在1 h内完成全部反应,通过肉眼观察颜色直接判定结果。本研究建立的LAMP方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便的优点,可用于MG感染的快速检测。     

鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据GenBank中DuCV基因序列,在保守区设计了6条特异性引物,并对反应条件进行优化,建立了一种适用于鸭圆环病毒（DuCV）的环介导等温扩增快速检测方法（LAMP）。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎、鸭副黏病毒均无扩增反应;且扩增反应只需在常规水浴锅中进行,1小时内即可完成反应;对DuCV模版DNA的最小检测限为10龟,灵敏度是一步法PCR的1000倍。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行DuCV的快速检测。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PR...     

燕麦镰孢菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立与应用

为了明确燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）快速检测方法,以荧光染料SYBR Green I为指示剂,以燕麦镰孢菌（F.avenaceum）的ITS序列为目的DNA片段,应用LAMP设计软件设计4条引物,优化LAMP反应体系和反应条件,用2%琼脂糖凝胶电泳和LAMP反应液颜色变化进行特异性和灵敏度验证,同时进行田间发病组织检测和土壤燕麦镰孢菌灵敏度验证。结果表明：优化的LAMP反应体系,最佳反应温度为65℃,反应程序为65℃下1 h,80℃下20 min。特异性检测结果表明,燕麦镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色（阳性）,对照和其他病原菌均呈橘色（阴性）。灵敏度验证结果表明,LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10 pg·μL^-1,每克土壤中检测的灵敏度为40个燕麦镰孢菌孢子。对采自甘肃省甘南州卓尼县和临潭县的20份疑似病害样本提取的DNA进行检测,其中13份为阳性,表明该技术能够有效的检测出青稞发病组织中的燕麦镰孢菌。本方法的建立与应用能为燕麦镰孢菌的检测及其青稞茎基腐病的诊断提供一种新技术。     

鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析

将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1。将 pET32a-vp1转化E.coli plys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达。纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性。本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

环介导等温扩增技术的改进及其在病原微生物检测中的应用研究进展

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出来的一种新型核酸扩增技术。自建立以来,该技术不断改进和发展,并广泛应用于病原微生物的检测,文章将就此展开综述。     

环介导等温扩增技术检测酸乳中蜡样芽孢杆菌

目的：建立快速准确检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的方法.方法：根据蜡样芽孢杆菌hblA基因设计特异性引物,通过环介导等温扩增技术（LAMP）直接检测酸乳中蜡样芽孢杆菌,扩增产物电泳检测.结果：LAMP法检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的特异性强,方法检出限6.4CFU/mL,人工污染检出限21CFU/mL.结论：LAMP法用于检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的灵敏度高、耗时短,为酸乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测提供了新的方法.