茶树低温胁迫转录因子CsICE的亚细胞定位及表达分析

 以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料,采用PCR技术扩增出与茶树低温胁迫相关转录因子CsICE的开放阅读框,长度783 bp。采用荧光定量PCR分析CsICE的表达量,结果表明CsICE在根、茎、叶、花和果中都有表达,在叶中表达量最高,是根、茎、果中表达量的4倍;在500 μmol ? L^-1 ABA处理下,幼叶中CsICE表达峰值是对照的40倍,在4 ℃低温处理下,最高值是对照的20倍,在10%聚乙二醇6000处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的5倍。亚细胞定位结果显示CsICE定位在细胞核上。     

茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

以茶树(Camellia sinensis)‘迎霜’为试验材料,采用同源克隆的方法,利用RACE和RT-PCR技术获得茶树NADPH氧化酶基因Cs RBOHA的c DNA全长(Gen Bank登录号:KJ782632)。该基因全长3 157 bp,开放阅读框2 769 bp,编码922个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为103.33 k D,理论等电点为9.28;C端序列较保守,N端序列保守性较低,与烟草和蓖麻的相似性达79%,进化关系最近;蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上,与预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,该基因的表达存在组织特异性,并且在低温(4℃)、高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、ABA(200 mg·L-1)和干旱(10%PEG 6000)条件下出现不同程度的上调。     

花青苷生物合成转录调控研究进展

花青苷生物合成由一系列结构基因编码的酶催化完成,而结构基因的表达受 MYB、bHLH和 WD40 这 3 类转录因子组成的 MBW（MYB-bHLH-WD40）转录复合体的协同调控。花青苷合成的转录调控研究最先在 30 多年前见于玉米、拟南芥和矮牵牛等模式植物,近年来在肉质果实上也取得了重要进展。在介绍果实花青苷的种类、分布与功能的基础上,回顾了 MYB、bHLH、WD40 这 3 类转录因子的基本特性及其在花青苷合成调控中的作用,进而就 MBW 转录复合体协同调控果实花青苷生物合成的机制研究的近年进展进行了综述。     

黄瓜 CsFT 基因的克隆及其功能分析

利用同源克隆的方法得到黄瓜的 FT 同源基因 CsFT,通过表达分析、进化树分析以及遗传转化拟南芥等方法初步验证了 CsFT 在黄瓜花发育过程中的作用。不同于之前的研究结果,CsFT 主要在雄花与雌花中表达,而在叶中基本不表达。异源过表达 CsFT 导致拟南芥提前开花,并且茎顶部出现顶端花,说明黄瓜的 CsFT 基因与拟南芥 AtFT 基因在开花调控上存在保守性。     

银杏GbERF1转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

ERF是植物中一类重要的转录因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的响应。以3年生银杏苗为试材,采用RT-PCR与RACE-PCR方法,研究了银杏ERF基因序列,以期深入了解银杏药用成分合成代谢的分子机理。结果表明:GbERF1含有长度为1 314bp的完整开放阅读框,编码437个氨基酸。蛋白序列分析显示,GbERF1蛋白含有2段ERF家族的特殊位点。GbERF1蛋白序列与北美云杉(ADE75663.1)序列的相似性为97%。系统进化树分析,GbERF1与北美云杉、狭叶羽扇豆的序列可划归为同一分支。实时荧光定量PCR结果显示,GbERF1主要在银杏根和叶中表达,逆境胁迫处理后显示,该基因在乙烯、紫外诱导处理下,表达量大幅度提升,随后下降,但仍高于对照组,干旱诱导处理下表达量先升高后降低,矮壮素(CCC)诱导下表达量变化不太明显。烟草叶片下表皮细胞亚细胞定位结果表明GbERF1定位于细胞核。     

西瓜ClWRKY54基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY转录因子是植物中所特有的一类转录因子,以基因家族形式存在,并在植物的生长发育和逆境响应等过程中发挥重要的作用。采用RT-PCR的方法从西瓜中分离得到一条西瓜CIRKY54基因。序列分析表明,该基因开放阅读框全长1 428 bp,编码475个氨基酸。其编码蛋白分子量约为51.82 KD,等电点为6.17。该基因蛋白序列中包含2个WRKY保守结构域,锌指结构为C2H2型,属于典型的1类WRKY基因。进化树分析显示,该基因蛋白序列同葫芦科作物中的甜瓜、黄瓜、西葫芦等的WRKY26具有较高的同源性,处于同一分支上。亚细胞定位分析显示,该基因编码蛋白定位于细胞核中。对该基因进行荧光定量PCR分析研究其表达特性,结果显示该基因在西瓜根、茎、叶中均有表达,但是在叶片中表达量最高;H_2O_2可以诱导该基因的表达,而乙烯处理可以抑制该基因的表达,这说明该基因可能参与逆境下H_2O_2和乙烯所介导的信号途径。在模拟干旱下,该基因表达无变化,说明该基因同干旱胁迫抗性不相关。本研究的结果将为进一步的解析ClWRKY54的功能奠定基础。     

金线莲ArLBD1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

以金线莲(Anoectochilus roxburghii)叶片的转录组数据为基础,采用RT-PCR技术克隆到了金线莲ArLBD1转录因子基因,采用生物信息学、原核表达、Western blot、亚细胞定位及qPCR等方法对该基因功能进行初步分析,以期为进一步研究其功能提供参考依据。结果表明：ArLBD1基因CDS长度864 bp,编码287个氨基酸。ArLBD1蛋白分子量为30.62 kD,理论等电点为6.25,不稳定系数55.55,属于不稳定蛋白。ArLBD1蛋白含有LOB superfamily保守结构域,第7～28氨基酸为C基序,第36～84氨基酸为GAS基序,第89～107氨基酸为类亮氨酸拉链基序,具有完整的类亮氨酸拉链基序,属于ClassⅠ。系统进化分析表明ArLBD1与拟南芥AtLBD36的亲缘关系最近,其次是AtLBD6。SDS-PAGE电泳及Western blot结果显示,ArLBD1基因在大肠杆菌中成功诱导表达。亚细胞定位分析发现ArLBD1蛋白定位在细胞核。qPCR分析结果表明,ArLBD1基因在金线莲叶、茎和根中都能检测到表达,在叶片表达量最高,其次是根,茎的...     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

‘秦冠’苹果MdWRKY基因亚细胞定位及原核表达

 以‘秦冠’苹果为试材,采用RT-PCR方法获得了一个WRKY基因,全长1 224 bp,推断其编码331个氨基酸,命名为MdWRKY。亚细胞定位分析MdWRKY蛋白分布在细胞核内,属于核蛋白。实时定量分析结果显示,MdWRKY基因受苹果斑点落叶病菌的诱导,表明其可能参与植物与病原菌的互作。随后进行原核表达分析,SDS/PAGE电泳结果表明表达蛋白与其蛋白大小一致。     

石榴新品种‘玛瑙红’

利石榴新品种‘玛瑙红’是‘大笨子’的优良芽变,成熟期比‘大笨子’晚 10 d 左右,平均单果质量 357.6 g,比‘大笨子’提高 50 g ;果实近圆形,果皮底色为黄白色,表面着美丽红霞,果面光洁鲜艳,外观品质优良,综合品质上等。成枝力、萌芽力较强,丰产、稳产;抗早期落叶病及干腐病能力较强,抗逆性较好。     

番茄转录因子基因SlWRKY16的克隆及原核表达分析

从栽培番茄(Solanumlycopersicum)‘M82’中克隆到1个WRKY家族基因SlWRKY16。研究结果显示:SlWRKY16包含1 497 bp的完整开放读码框,编码498个氨基酸,理论分子量为55.5 kD,含有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于Ⅱb类WRKY转录因子基因,且定位于细胞膜上;栽培番茄Sl WRKY16与潘那利番茄Sp WRKY6(XP₀15064265.1)、马铃薯St WRKY6(XP₀06350473.1)同源性最高。qRT-PCR结果显示SlWRKY16在番茄不同组织中均有表达,叶片中的表达量最高;短时间非生物胁迫下该基因的表达量显著降低。此外,重组菌pET-30a-SlWRKY16在NaCl、甘露醇胁迫下生长均明显低于对照菌pET-30a。综上,番茄SlWRKY16基因可能在响应非生物胁迫过程中具有负调控效应。     

结球甘蓝花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析

以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）E1 花粉为试材,对萌发前后的花粉总蛋白进行双向电泳及差异蛋白质谱分析,发现延伸因子 BoEF-Tu 蛋白在花粉萌发后较萌发前表达上调。利用同源克隆得到甘蓝 BoEF-Tu 基因的全长 cDNA 序列,其长度为 1 728 bp,具有一个完整开放阅读框（ORF）,位于 112 ~ 1 473 bp 处,编码 453 个氨基酸残基,预测分子量为 49.17 kD,等电点为 6.52。生物信息学分析表明：BoEF-Tu 蛋白含有 9 个 α–螺旋结构,18 个 β–折叠结构,不含信号肽和跨膜区,在106 ~ 121 位氨基酸残基处有 1 个 GTP 结合区域（DKAPEEKKRGITIATA）。氨基酸同源性分析表明,BoEF-Tu 与拟南芥 EF-TuM 同源性较高,达到 93%;系统进化分析表明,BoEF-Tu 与拟南芥 EF-Tu 的亲缘关系最近。     

葡萄 SNP 标记的 CAPS 和 TSP 分析

为了建立起葡萄 SNP 标记分析的一般方法和探索 EST-SNP 标记在葡萄中的应用,对前期开发的葡萄 EST-SNP 位点进行了筛选,设计了 28 对 CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences,酶切扩增多态性序列）标记引物和 22 对 TSP（Temperature-switch PCR,温度转变 PCR）标记引物,并在 31份葡萄材料中进行了分析,其中 20 对 CAPS 引物和 10 对 TSP 引物电泳条带较清晰,多态性较好。基因分型统计显示：所有的 SNP 位点均含有 2 个等位基因,平均多态性信息含量（PIC）为 0.336,平均Shannon’s 信息指数为 0.511。基因分型和葡萄材料聚类结果均显示这两种方法所获结果提供的信息量大且结果可靠。本方法简便、成本低,可作为 SNP 分型有效方法用于葡萄品种鉴定、基因分型和遗传多样性分析等。     

基因枪介导红叶石楠遗传转化因素分析

以红叶石楠（Photinia fraseri）的胚性愈伤组织为受体材料,利用基因枪法导入外源抗寒基因 rd29A,以期建立基因枪转化红叶石楠的技术体系。结果表明,基因枪转化红叶石楠的最佳组合条件为：胚性愈伤组织在诱导培养基 MS + 6-BA 2.0 mg ·L-1+ NAA 5.0 mg ·L-1+ 2,4-D 0.5 mg ·L-1+ 琼脂 5.0g ·L-1+ 蔗糖 20 g ·L-1里,用 0.3 mol ·L-1甘露醇处理 15 ~ 16 h;基因枪轰击时添加 12.5 mol ·L-1氯化钙50 μL+0.1 mol ·L-1亚精胺 50 μL,每枪含金粉 300 μg + 质粒 DNA3.0 μg,轰击距离 9 cm,轰击压力 1 100psi,轰击次数 1 次。经多次筛选获得了 6 株转基因植株,转化植株经 PCR 检测和 Southern 分析,证实了rd29A 已经整合到红叶石楠基因组中。     

苹果MdGA20ox1 基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 以苹果砧木SH40[（Malus × domestica）× M. honanensis]为试材,采用RT-PCR 结合RACE 技术从SH40 茎尖中克隆得到一个赤霉素合成关键酶基因（GA20–氧化酶基因）,命名为MdGA20ox1, 其cDNA 全长1 579 bp,编码392 个氨基酸。该基因在GenBank 登录号为KC493633。氨基酸序列同源性 分析表明：MdGA20ox1 与玉米、拟南芥、梨等植物GA20ox 具有55.9% ~ 96.7%的相似性。洋葱表皮细 胞瞬时表达显示,MdGA20ox1 蛋白定位于细胞核与细胞质膜。植株生长量测定和相对定量表达结果表明, MdGA20ox1 基因在砧木SH28、SH40 和M26 自根苗的表达呈先下降再上升然后下降的趋势,这与其生长 动态基本一致。嘎啦/SH28 的植株生长量和MdGA20ox1 表达量最高,嘎啦/M26 次之,嘎啦/SH40 最低, 初步表明该基因的表达有与苹果植株矮化程度呈负相关的趋势。MdGA20ox1 在嘎啦/SH40 和嘎啦/SH28 不同组织中的表达模式一致,且半矮化类型砧木SH28 嫁接‘嘎啦’,其茎尖、幼叶、成熟叶和枝皮中的 表达量均高于矮化类型SH40 嫁接‘嘎啦’。     

豆梨NAC转录因子基因PcNAC1的克隆、亚细胞定位及功能初探

根据豆梨(Pyrus calleryana Dence)接种黑斑病菌后的转录组测序结果,筛选出一个上调表达的NAC转录因子基因。从豆梨中获得了该基因的全长片段,并将其命名为PcNAC1。该基因的开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。将PcNAC1蛋白序列与其他物种蛋白序列进行对比,并构建系统进化树后发现,其与小麦TaNAC4及拟南芥ATAF1具有较高同源性。通过实时荧光定量分析PcNAC1在豆梨不同组中的表达发现,PcNAC1在茎、叶和根中表达量较高,在花和果中表达量较低。构建了亚细胞定位载体,瞬时侵染本氏烟,通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布情况,发现该基因行使功能的主要区域定位在细胞核。进一步在本氏烟中瞬时表达PcNAC1,接种烟草疫霉病菌后发现PcNAC1可以通过调控植物激素通路防卫反应基因的表达来增强植物的抗病性。     

番荔枝节律钟输出基因AsGI的克隆、亚细胞定位与表达分析

GIGANTEA基因在植物开花和生理节律变化过程中起着重要作用。利用同源克隆和RACE-PCR的方法获得番荔枝GIGANTEA基因的全长cDNA序列,命名为AsGI,GenBank登录号为KR095281。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsGI基因长为3 465 bp,编码1 154个氨基酸。氨基酸序列比对显示与葡萄和油棕的GI的相似度分别为77%和76%。构建类似蛋白系统进化树显示,番荔枝AsGI与香蕉、海枣、油棕等分子进化距离较近。预测AsGI蛋白为转录因子,定位在细胞核中,为非分泌性蛋白质,不具备信号肽。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化烟草上表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草上表皮细胞的细胞核中有绿色荧光。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的器官中,AsGI的表达量存在差异,在叶片、花蕾和成熟花中的表达量相对较高。AsGI呈现昼夜节律表达模式,长日照下叶片中AsGI在白昼的表达高于短日照处理。在4月、6月和8月,AsGI的表达量相对较高。该基因可能作为番荔枝花期调控分子育种的目标基因。     

新型试管花卉姬松高效再生体系的研究

以新型试管花卉多肉类植物姬松（Crassula clavata N. E. Brown）为材料进行高效再生体系的研究。结果表明：以姬松茎尖为外植体的初代培养中,MS 培养基添加 IBA 并未诱导出根系生成,而是直接诱导出丛生芽,在 MS + IBA0.3 mg ·L-1培养基上,由叶片表面诱导出的丛生芽质量最佳;在继代培养中,最佳培养基为 MS + NAA0.1 mg ·L-1+ 6-BA 0.5 mg ·L-1,诱导产生大量胚性愈伤组织,且表面有芽体分化;在彩色培养中,在 1/2MS 中添加 0.25 mg ·L-1的食用色素亮蓝,观赏效果佳且对植株生长无毒害。     

抗青枯病番茄新品种‘益丰 2 号’

‘益丰 2 号’番茄是以 g-8 为母本,g-4 为父本配制而成的番茄一代杂种。植株无限生长型,生长势强。幼果无绿肩,果面有光泽,果实圆形,成熟果鲜红色,着色均匀,硬实,耐裂,耐贮运。抗青枯病,适应性强,单果质量 110 g 左右,产量 50 ~ 60 t ·hm-2,适宜在华南地区春、秋露地种植。     

杧果新品种‘桂热杧 3 号’

‘桂热杧 3 号’是从‘黄象牙杧’的实生后代选出的杧果新品种,果实外观美、平均单果质量 305 g,肉质细滑、汁多、味蜜甜、芳香,表现质优,结实早,丰产稳产。