茶树低温胁迫转录因子CsICE的亚细胞定位及表达分析

 以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料,采用PCR技术扩增出与茶树低温胁迫相关转录因子CsICE的开放阅读框,长度783 bp。采用荧光定量PCR分析CsICE的表达量,结果表明CsICE在根、茎、叶、花和果中都有表达,在叶中表达量最高,是根、茎、果中表达量的4倍;在500 μmol ? L^-1 ABA处理下,幼叶中CsICE表达峰值是对照的40倍,在4 ℃低温处理下,最高值是对照的20倍,在10%聚乙二醇6000处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的5倍。亚细胞定位结果显示CsICE定位在细胞核上。     

茶树CsSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分析

为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3低温条件下的表达变化

将草菇(Volvariella volvacea)菌株V23和耐低温诱变菌株VH3的菌丝体在4℃下处理不同时间后,采用荧光定量PCR技术中的双标准曲线法研究了S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3的表达变化。结果显示,低温处理后,草菇V23菌株的Cor3基因表达量随处理时间的延长呈不断下降趋势,10h时,其表达量仅为对照的7%。而VH3菌株Cor3基因4℃处理2h表达量明显上升,为对照的1.8倍,处理4h和6h表达量降低,分别为对照的80%和90%,处理8h的表达量又上升,为对照的1.4倍,随后下降,处理10h表达量最低,为对照的60%。根据结果初步推测Cor3基因与草菇低温耐受性具有一定相关性。     

茶树蛋白激酶基因CsCIPK的克隆与表达特性分析

以茶树品种‘龙井43’作为材料,利用RT-PCR方法,从茶树的cDNA中克隆得到1个编码蛋白激酶的基因,命名为CsCIPK。序列分析表明,CsCIPK开放阅读框长度为1 341 bp,编码446个氨基酸,蛋白质分子量为414234。蛋白功能域预测和多重对比显示,CsCIPK蛋白含有1个保守的N端激酶结构域和1个相对不保守的C端调节结构域,即丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和NAF结构域。理化性质、亲/疏水性、无序化分析显示,CsCIPK属于疏水性蛋白,理论等电点为7.04,有4段无序化区域,其二级结构分析显示主要由α螺旋、不规则卷曲组成。通过实时荧光定量PCR对‘龙井43’和‘安吉白茶’中的CsCIPK表达特性进行分析。结果显示‘龙井43’中CsCIPK的相对表达量在高温、干旱及盐处理4 h、低温处理24 h时达到最高。‘安吉白茶’中CsCIPK的相对表达量在高温及盐处理4 h、低温及干旱处理1h时达到最高。CsCIPK在‘龙井43’的根中,‘安吉白茶’茎中表达量最高。不同浓度的GA和IBA处理‘龙井43’茶苗,结果显示0.2 mmol·L-1 GA处理后,CsCIPK表达量先升高后下降,6 d时处理组为对照组的62倍;0.6 mmol·L-1 IBA处理后,CsCIPK的表达量在3 d时显著高于对照组;不同浓度GA和IBA处理后,9 d时CsCIPK表达量均显著低于对照。     

南瓜热激蛋白相关基因CmHSP70-5 的克隆和高温胁迫下的表达分析

基于南瓜基因组序列,采用PCR 的方法从南瓜cDNA 中克隆1 个热激蛋白相关基因,命名为CmHSP70-5,采 用生物信息学方法分析该基因编码的蛋白与其同源蛋白的系统发育关系,利用荧光定量PCR 研究南瓜幼苗在高温胁迫下 CmHSP70-5 基因的表达量。结果表明：CmHSP70-5 基因全长1 953 bp,其编码的CmHSP70-5 蛋白与拟南芥AtHSP70-5 的亲缘关系最近。未经高温处理时CmHSP70-5 基因在根中的表达量要显著高于茎和叶。在高温胁迫下,根、茎、叶中 CmHSP70-5 基因均呈现上调表达,均在处理后3 h 表达量达到最大,说明CmHSP70-5 基因的表达与南瓜高温胁迫有关。     

茄子SmNAC1 基因的克隆与表达分析

 以茄子幼苗为试材,利用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得SmNAC1 基因全长,并利 用RT-qPCR 技术检测该基因在GA、4 ℃低温、NaCl 处理下的时空表达。结果显示：SmNAC1 全长序列 1 279 bp,开放阅读框为909 bp,编码302 个氨基酸,推测其蛋白质分子量约35.04 kD;SmNAC1 含有 NAC 家族的N 端保守域,与番茄、马铃薯同源性高达90%。SmNAC1 受GA、低温和高盐诱导,表达上 调,但在根、茎、叶中的表达量有差异,在根中表达水平整体高于茎和叶中,显示SmNAC1 在根中优势 表达,且短时间（0.5 ~ 1 h）相对表达量较高,而在茎和叶中应答相对迟缓,且叶中表达水平趋于稳定。 可见SmNAC1 可能参与了茄子对外源GA 诱导的响应及对低温、高盐胁迫的耐受调节过程。     

低温胁迫下龙眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆与表达分析

 应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时发现碳酸酐酶（CA）蛋白下调表达。利用RT-PCR方法克隆CA基因的全长cDNA,GenBank登录号JN033201,长度为1 119 bp,包括1个966 bp的开放阅读框,编码321 bp的氨基酸序列,同源性分析表明,12个不同植物同源性为81% ~ 88%。龙眼CA基因具有典型的CA结构域,并且非常保守。实时荧光定量分析结果表明,CA在龙眼根、茎、叶中都有表达,为组成型表达,在叶中的表达量最高,茎和根中的表达量最少。CA基因在低温胁迫下随着低温胁迫时间的延长而发生变化。将CA在大肠杆菌中表达,获得1个约40.5 kD的外源蛋白。推测CA表达与低温胁迫有关。     

低温胁迫对草菇菌丝体糖原磷酸化酶基因表达的影响

在0℃低温胁迫下比较低温敏感型草菇(Volvariella volvacea)菌株V23和耐低温型菌株VH3糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase)pyg基因的表达情况。以α-微管蛋白为内参基因,采用实时荧光定量PCR技术测定pyg基因的表达,结果表明:低温处理4h时,V23的pyg基因相对表达量仅为0h的0.49倍,低温处理6h时有所回升,但仍低于处理0h的水平。VH3的pyg基因相对表达量从低温处理2h时急剧下降,至低温处理8h时达到最低值,仅为0h的0.28倍。随着低温处理时间的延长,pyg基因的相对表达量在V23和VH3中均呈下降趋势,相同的低温处理时间下,该基因在菌株V23中的下降幅度小于VH3中。     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

 以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1 011 bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2 h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12 h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4 h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1011bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR，该基因全长639 bp，编码212个氨基酸，属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员，具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近，在不同物种间，与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近；理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白；结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域，三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示，CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著；对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析，‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高；‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高，干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达，表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

多年生黑麦草P5CS基因的cDNA克隆、表达及亚细胞定位

以多年生黑麦草(Lolium perenne)‘Derby'为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶基因(P5CS)的cDNA序列,全长2528bp,推断其编码716个氨基酸,命名为LpP5CS。序列分析表明:LpP5CS基因与小麦TaP5CS和水稻OsP5CS基因核苷酸序列的相似性分别为92.05%和85.82%,氨基酸序列的相似性分别为93.99%和87.99%。半定量PCR结果表明,LpP5CS基因在多年生黑麦草根、茎,叶均有表达。盐处理下,表达量高于对照,其中叶片中表达量最高,根中最低。200mmol·L-1NaCl处理下,LpP5CS基因表达量随处理时间延长,有先升高后降低的趋势。洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达显示,LpP5CS蛋白定位于细胞膜和细胞核。     

大岩桐SsKN1基因的克隆及组织表达分析

以大岩桐(Sinningia specisoa)茎尖组织为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsKN1(KNOTTED1-like homeobox)基因进行克隆,经BLAST比对、邻接法构建进化树,研究了SsKN1基因与其它KNOXI基因的亲缘关系;并利用半定量RT-PCR,研究了SsKN1基因在大岩桐根、花瓣、花萼、叶、茎和茎尖等不同组织中的表达情况,以期为SsKN1基因的功能研究奠定基础。结果表明:获得了大岩桐SsKN1基因451bp的cDNA序列,该基因与烟草NTH15基因亲缘关系最近,其次为拟南芥STM基因;SsKN1基因在根、叶、茎尖和花萼等4种组织中表达,在花瓣和茎中不表达。其中在茎尖的表达量最高,叶中的表达量次之,根和花萼的表达量较低。     

猕猴桃AdCCS1基因的克隆及其表达调控

采用RT-PCR法从‘米良1号’猕猴桃中分离到1 066 bp的铜锌超氧化物歧化酶分子伴侣蛋白基因AdCCS1,登录号为KY471361。AdCCS1的开放阅读框为984 bp,编码327个氨基酸,包含3个典型结构域（N端结构域、中间结构域和C端结构域）和2个保守的金属结合位点（MXCXXC和CXC）。基因结构分析显示AdCCS1由6个外显子和5个内含子组成。系统进化分析表明AdCCS1聚在双子叶植物分支中,与茶树CsCCS的亲缘关系最近。此外,AdCCS1的5′端调控区存在多种光响应、胁迫响应和激素响应应答元件。定量PCR分析显示,AdCCS1在猕猴桃叶片中的表达量最高,其次是成熟果、花、幼果和茎,在根中的表达量最低。猕猴桃果实中AdCCS1在4 ℃低温贮藏过程中的表达量均比25 ℃贮藏中同期的低,说明低温抑制AdCCS1的表达。脱落酸和赤霉素处理后AdCCS1的表达下调,但二者的应答模式不同。     

湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫下的表达分析

 为了分析WRKY40抗病抗逆作用,以湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp）Rehd.]为试材,利用特异引物进行RT-PCR基因克隆,利用实时荧光定量PCR方法分析组织中基因的表达及低温、高盐、干旱、PEG6000胁迫和外源IAA、ABA处理对基因表达的影响。结果表明,克隆到的片段长度为1 240 bp,包含一个完整的开放阅读框,长999 bp,编码333个氨基酸。该基因与拟南芥AtWRKY40同源,故命名为MhWRKY40b,GenBank登录号为JX112913。基因表达分析表明,MhWRKY40b在根、茎、叶等组织均有表达,其中在花萼、花辨、果实中表达量较高。该基因明显受低温、高盐、干旱胁迫诱导表达,最高相对表达量可达20倍以上;而受PEG、苹果白粉病菌及外源ABA和IAA轻微诱导,最高相对表达量在10倍以下。MhWRKY40b除了在抗白粉病方面与AtWRKY40具有相似功能外,可能还在湖北海棠的抗寒、抗盐、抗旱过程中起到比较重要的作用。     

辣椒TPS家族成员的鉴定与CaTPS1的表达分析

利用生物信息学方法,从辣椒全基因组数据库中共鉴定出11个辣椒TPS基因,除Ca TPS3含有1个TPS和2个TPP结构域外,其余分别含有1个TPS和1个TPP结构域。11个Ca TPS分为2类,ClassⅠ包含3个基因(Ca TPS1~Ca TPS3),分别含有16、16和13个内含子,Ca TPS1和Ca TPS2含Motif 1~Motif 5各1个,而Ca TPS3含有2个Motif 4和1个Motif 3。ClassⅡ包含8个基因(Ca TPS4~Ca TPS11),均含有2个内含子,且分别含Motif 1~Motif 6各1个。利用荧光定量PCR对Ca TPS1在辣椒组织表达的特异性和低温应答模式进行分析,结果表明:Ca TPS1在叶片中的表达量大约是根和茎中的5~6倍,说明Ca TPS1的表达具有明显的组织特异性;低温处理后Ca TPS1在根和茎中的表达高峰出现时间明显早于叶片,说明不同组织中Ca TPS1对低温胁迫的应答时间存在一定差异。     

牡丹开花调控转录因子基因PsCOL4的克隆、表达与系统进化分析

采用RT-PCR 方法从‘紫罗兰’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）花芽中克隆得到1个重要开花调控转录因子基因CONSTANS-like,其cDNA 全长1 125 bp,编码373 个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含两个B-box 型锌指结构和1 个CCT 结构域,与拟南芥的AtCOL4 最为相似,将其命名为PsCOL4,GenBank 登录号为KF113358。系统进化树分析表明,PsCOL4 与葡萄编码的VvCOL4的亲缘关系最近,属于第1 群组CO 类似基因。实时定量PCR 表明,PsCOL4 在不同组织器官中均有表达,其中茎和叶中的表达量最高,根中最低。在花芽不同发育时期,PsCOL4 的表达呈现递减趋势。不同光周期条件下,PsCOL4 的表达稍有不同,短日照条件下在叶中的表达有所增加,茎中稍有减少。     

CaCl_2对NaCl胁迫下酸枣苗AsA-GSH循环的影响

以酸枣(Ziziphus acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu)水培实生幼苗为试材,研究了CaCl_2对NaCl胁迫下其根、茎、叶中抗坏血酸—谷胱甘肽循环(AsA-GSH)的影响。结果表明:与对照(日本园试配方营养液)相比,NaCl处理下根和叶中AsA含量升高,MDHAR活性升高,APX活性下降;根、茎、叶中GSH含量升高。NaCl+CaCl_2处理与NaC处理相比,根和茎中AsA含量进一步升高,叶中AsA含量下降,叶中APX下降,根中MDHAR活性进一步升高,茎和叶中DHAR活性升高;根和叶中GSH含量下降。外源CaCl_2可能通过提高酸枣实生苗根、茎和叶中AsA再生关键酶MDHAR和DHAR活性,促进根和茎中AsA的再生与生物合成,从而提高根、茎清除过量H_2O_2的能力,缓解NaCl胁迫对酸枣幼苗根和茎部的伤害。     

香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2克隆及表达特性分析

在获得MaTPS2基因全长序列的基础上,采用同源序列比对、聚类分析、实时定量PCR等技术初步探讨香蕉MaTPS2基因的功能。从香蕉A基因组中获得一条3 277bp MaTPS2全长序列,包含一个完整的开放阅读框1 344bp,编码蛋白含447个氨基酸。其氨基酸理化性质分析表明,MaTPS2蛋白属于不稳定疏水性蛋白,具有一个结构域GT1-TPS。通过与已知植物的TPS氨基酸同源序列比对,同源性达77.95%。系统发育树进化关系分析表明,MaTPS2编码的氨基酸序列与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)邻近,说明二者的亲缘关系较近。器官特异性分析表明,MaTPS2在香蕉植株的根、球茎、假茎、叶、花各器官中均有表达,其中在球茎、假茎和叶中表达量较多,在果实中表达量较低。在ABA、干旱、盐害和枯萎病菌胁迫处理下,MaTPS2表达量升高,在ACC胁迫处理下,MaTPS2表达量显著下降,而低温胁迫条件下,MaTPS2表达不响应。由此推导,MaTPS2可能参与调控香蕉抗旱、抗病机制。植物生长调节剂ACC和ABA胁迫处理说明MaTPS2的表达可能受激素蛋白间接调控。