青稞叶绿体基因RNA编辑位点的预测、鉴定与比较分析

为了阐明青稞叶绿体基因组RNA编辑位点的组成与特性,首先利用生物信息工具对青稞叶绿体基因的RNA编辑位点进行了预测,结果发现了35个分布于15个基因的编辑位点,所有编辑均为C到U的转换,其中基因ndhB包含的编辑位点数量最多,达9个,这与其他麦类作物相似;进一步利用RT-PCR结合克隆测序,对预测的35个位点进行了实验验证,发现18个编辑位点被证实发生了C到U的编辑;对编辑前后编码蛋白质的结构进行了比较分析,发现RNA编辑引起了编码蛋白的结构变化,暗示RNA编辑可以造成编码蛋白功能的改变。最后,将青稞叶绿体基因RNA编辑位点与栽培大麦、野生大麦的叶绿体RNA编辑位点进行了比较,发现青稞与栽培大麦的RNA编辑组成完全一样,而野生大麦缺失了 ndhA-563位点,初步印证了大麦的起源进化关系。     

大麦叶绿体基因RNA编辑位点的预测与鉴定

RNA编辑是一种特殊的转录后加工过程,是陆生植物叶绿体基因组在转录后水平上调控基因表达的一种重要方式。为了给研究叶绿体基因RNA编辑功能及其发生机制提供依据,以栽培大麦为研究对象,采用生物信息学方法对其叶绿体的83个蛋白编码基因的RNA编辑位点进行预测和分析。结果在16个基因中发现了37个RNA编辑位点,且均为C到U的转换,其中5个发生在密码子的第一位,32个发生在密码子的第二位,未发现发生在密码子第三位的RNA编辑;采用blast工具,与NCBI数据库中的大麦EST序列进行了对比,确定其中的34个编辑位点是真实存在的,其中ndhB基因最多,为8个编辑位点;进一步利用生物信息学工具分析了ndhB中RNA编辑对其编码蛋白质的跨膜结构域和二级结构的影响,结果表明,ndhB 467的编辑会引起蛋白质跨膜结构的增加,ndhB 149的编辑会引起蛋白质二级结构的改变。最后还将预测的大麦编辑位点与其他4种禾本科叶绿体的编辑位点进行了比较。     

野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑位点的预测、鉴定与分析

RNA编辑是高等植物叶绿体基因转录后表达调控的一种重要方式。为了解野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑的组成及其与其他麦类作物的异同,通过生物信息学预测结合RT-PCR的方法,对野生二粒小麦叶绿体基因的RNA编辑位点进行了预测和鉴定。生物信息学预测共发现了分布于15个基因上的35个编辑位点,均为C到U的转换,其中ndhB基因包含的编辑位点数量最多,达9个;在此基础上,随机选取5个基因对其编辑位点进行了测序验证,结果共鉴定了18个C→U的编辑位点;进一步对编辑后编码蛋白的二级结构和跨膜结构域进行了预测,发现编辑后所有基因均发生了二级结构的改变,但只有ndhB基因的跨膜结构域发生了改变;最后,将确定的野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑位点与7个禾本科物种的RNA编辑位点进行比较,共发现17个编辑位点在这些种间具有保守性,相比于其他物种,野生二粒小麦与普通小麦和粗山羊草具有更相似的编辑位点组成。     

二穗短柄草叶绿体RNA编辑位点的预测及其鉴定

RNA编辑是陆生植物叶绿体转录后基因表达调控的一种重要方式。为进一步探讨单子叶植物RNA编辑功能及其发生机制,本研究通过生物信息学方法,对二穗短柄草叶绿体的81个蛋白编码基因的RNA编辑位点进行了预测和鉴定分析,结果发现78个基因存在编辑位点,共检测到176个编辑位点,都是C到U的转换。其中ndhB最多,为14个编辑位点。为验证预测结果,利用blast工具比对了NCBI的二穗短柄草EST数据库,最终确定存在于17个基因中的34个编辑位点是真实存在的,其中19个为沉默编辑,15个为有效编辑。与5个不同单子叶禾本科物种18个蛋白编码基因的RNA编辑位点的比较发现,在rpoB-206位点,只有二穗短柄草发生了编辑,且只有ndhD-295(293)为部分编辑位点。     

粗山羊草新型硬度等位基因的克隆及分析

小麦籽粒硬度是其最为重要的品质性状之一,现已发现控制小麦籽粒硬度的主效基因是Pina和Pinb。为了丰富籽粒硬度新型等位基因,根据已报道的小麦Pina和Pinb基因的保守序列,设计了2对特异性引物,对粗山羊草（Aegilops tauschii)进行Pina和Pinb基因的PCR扩增、克隆及序列分析。结果表明,本研究共得到2个新型Pina等位基因和3个新型Pinb等位基因,核酸序列长度均为447 bp,编码148个氨基酸残基,具有麦类作物PINA和PINB蛋白所特有的色氨酸结构域：WRWWKWWK和WPTKWWK。与已知的Pina和Pinb基因序列相比较,这些基因含有多个SNP变异位点,丰富了小麦籽粒硬度改良的遗传资源。[JP]     

粗山羊草高分子量谷蛋白亚基组成分析

为了发现能够用于小麦品质改良的优异高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS),应用SDS-PAGE技术分析了47份粗山羊草Glu-Dt1位点的HMW-GS组成,分别检测到5种x-型亚基(1.1t、1t、1.5t、2t、3t)和4种y-型亚基(10.1t、11t、12t、12.4t).其中,1Dx1.1t是1种新的x-型亚基,它的迁移率比普通小麦的1Ax1亚基稍慢,这是目前在粗山羊草中发现的分子量最大的HMW-GS.供试粗山羊草中有8种HMW-GS组合类型:1.1t 11t、1t 11t、1.5t 12t、2t 10.1t、2t 11t、2t 12t、2t 12.4t和3t 11t.其中,1.1t 11t和2t 12.4t未见报道.     

粗山羊草和二穗短柄草SOD基因成员的鉴定与比较分析

为给超氧化物歧化酶(SOD)基因克隆和功能研究奠定基础,以粗山羊草和二穗短柄草的基因组序列为材料,利用生物信息学手段对SOD基因家族成员进行鉴定和分析。结果表明,两种植物总共鉴定出12个SOD基因,其中二穗短柄草7个,粗山羊草5个;它们的编码区全长327~2 145bp,编码108~714个氨基酸,保守基序数量1~4个,等电点4.84~9.25;Cu/Zn-SOD、Fe-SOD与Mn-SOD的数量分别为8、3和1个,在粗山羊草基因组中没有鉴定到Mn-SOD基因;3种不同类型的SOD在进化树上处于不同分支。除Bradi2g30580.2和Bradi1g50550.1外,其他二穗短柄草的SOD基因在粗山羊草中均有同源基因。     

粗山羊草JAZ基因家族的全基因组鉴定与分析

为了挖掘可用于小麦茉莉酸调控通路及其穗部或花器官发育研究的候选基因,基于已发布的粗山羊草全基因组数据,利用生物信息学分析方法鉴定了粗山羊草JAZ基因家族,并从染色体分布、基因及蛋白结构、启动子顺式作用元件、系统进化关系和基因表达模式等方面对该基因家族的特征进行了比较分析。结果表明,本研究共鉴定到9个粗山羊JAZ基因,命名为AetJAZ1-AetJAZ9。染色体定位结果显示,9个粗山羊草JAZ基因分别定位在2D、5D、6D和7D染色体上,其中在7D染色体上分布最多。进化分析表明,粗山羊草JAZ蛋白与短柄草JAZ蛋白亲缘关系最近,且9个粗山羊草JAZ蛋白被分别聚类到了S5、S12、S13、S16和S20五个亚族中,其中S20亚族有五个粗山羊草JAZ蛋白。启动子分析表明,9个粗山羊草JAZ基因启动子顺式作用元件种类和数量存在差异,推测其各自的功能也存在差异。表达谱分析表明,粗山羊草JAZ基因在粗山羊草不同组织间存在不同的表达特性,且不存在组成型表达基因,其中,AetJAZ1和AetJAZ2表现出明显的组织特异性,分别只在穗部、雌蕊和雄蕊中特异表达。     

两种山羊草携带Gc基因的新发现

由栽培二粒小麦和沙融山羊草形成的双二倍体，再和高大山羊草一起，替换了普通小麦细胞质，形成代换系。这个代换系的后代携带两个新的Ｇｃ基因，Ｃ－－带分析表明：一个基因位于高大山羊草５Ｓ＾１染色体或类似５Ｓ＾１的染色体上，而另一个基因，位于沙融山羊草的４Ｓ＾１染色体上。     

偏凸-柱穗山羊草多倍双二倍体SDAU18的鉴定

利用偏凸山羊草和拄穗山羊草杂交人工合成了多倍多倍双二倍体SDAU18，并对SDAU18及其双亲的细胞学及主要性状特点进行了鉴定。结果表明，偏凸山羊草和柱穗山羊草的花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ（PMC M1）的染色体构型均为14Ⅱ；SDAU18的根尖细胞（RTC）染色体数目为2n=56，PMC M1的染色体构型基本上为28Ⅱ．是一个偏凸山羊草和拄穗山羊草的完全多倍多倍双二倍体；SDAU18在株高、穗长、每穗小穗数、穗粒数、千粒重等方面都优于其双亲，且对白粉病、条锈病表现免疫。     

节节麦大穗大粒相关农艺性状的遗传分析

节节麦(Aegilops tauschii,DD)是六倍体普通小麦D基因组的祖先,其自然类群中含有丰富的抗逆、高产基因,利用其与四倍体硬粒小麦合成的六倍体小麦在现代小麦育种中得到了愈来愈多的应用。本课题在野生节节麦类群中发现了大穗、大粒材料AT462,利用其作母本与节节麦材料AT18(强分蘖)杂交;构建了F2、F3群体,通过调查亲本和群体单株的穗长、小穗数、粒长、粒宽和粒重等表型,对这些穗部性状进行了相关性分析和遗传分析。结果表明:(1)在F2和F3群体中,粒重、粒长与穗长之间不存在显著相关性,而且穗长与粒宽之间在两个群体中的平均相关系数绝对值小于0.1,粒重与小穗数之间的相关系数绝对值小于0.2,表明节节麦大粒相关性状不受穗长的影响,受小穗数影响也较小;(2)采用F2单世代分离分析的方法对节节麦AT462×AT18的F2群体大穗、大粒相关性状进行遗传分析,其中穗长受2对具有加性效应的主效基因控制;粒重和小穗数均同时受2对基因的加性效应、显性效应以及互作效应控制,其中加性效应占主导地位;粒长、粒宽均受2对基因的加性效应、显性效应以及互作效应控制,且三种效应较为均衡。这说明控制节节麦粒重、穗长、小穗数等产量性状相关基因的加性效应在遗传中占主导地位,在育种中较易利用,且其主效基因的遗传力达0.9。     

不同谱系节节麦的杂种优势分析

节节麦含有丰富的优良基因,可用于小麦的品质改良和产量提高。为了揭示L1和L2谱系节节麦的遗传差异和杂种优势,对L1、L2谱系节节麦开展人工杂交,采用SSR分子标记鉴定杂种F1的真实性,对其花粉活力和F1减数分裂时染色体配对情况进行观察,并对其主要农艺性状进行了调查和统计分析。结果表明,长期的地理隔离使L1和L2谱系节节麦产生一定的遗传分化,但尚未形成生殖隔离。F1的花粉活力和同源染色体配对正常,绝大部分F1的中期同源染色体联会形成环状染色体,少数出现棒状染色体。对8个杂交组合的16个主要农艺性状的统计分析表明,L1、L2谱系节节麦的百粒重和分蘖数存在杂种优势,尤其是杂交组合AY26×AY46和XJ47×AY46,其百粒重(IH>143%,OPH>21%)和分蘖数(IH>187%,OPH>57%)存在显著的杂种优势。有望通过对这2个杂交组合的进一步深入研究,揭示节节麦杂种优势的分子机理,为其在小麦产量育种中的有效利用奠定基础。     

节节麦幼胚再生体系的建立

为建立高效的节节麦幼胚再生体系,以节节麦幼胚为外植体,通过正交设计,探索基本培养基、2,4-D、碳源、KT等因素对幼胚愈伤组织诱导、分化及植株再生效果的影响。结果表明,4种因素中,基本培养基对节节麦幼胚愈伤组织诱导的影响最显著(P0.05),2,4-D浓度对节节麦幼胚愈伤组织诱导也有显著影响(P0.05),添加3.0mg·L~(-1) 2,4-D的培养基诱导出的愈伤组织质量高,淡黄色,表面呈不规则颗粒状,质地致密,再生频率可以达到17.62%。KT浓度对节节麦愈伤分化影响最显著,基本培养基、2,4-D和碳源对节节麦幼胚愈伤分化均无显著影响。不同碳源对节节麦幼胚愈伤组织诱导和分化的影响均不显著,为节约成本可直接选用30g·L~(-1)蔗糖作为碳源。节节麦幼胚组织培养的最佳组合是:愈伤诱导培养基为MS培养基+3mg·L~(-1) 2,4-D+15g·L~(-1)蔗糖+15g·L~(-1)甘露醇,愈伤分化培养基为MS培养基+15g·L~(-1)蔗糖+15g·L~(~(-1))甘露醇+1.0mg·L~(-1) KT。     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

节节麦不同生育期叶片蜡质组成和超微形态的变化

为了解节节麦(Aegilops tauschii Coss.)不同生育期叶片表皮蜡质组成及晶体形态的变化,对节节麦叶片蜡质进行提取,利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪和气相色谱-火焰离子化检测仪(GC-FID)对蜡质进行了定性和定量分析,并采用扫描电镜(SEM)对叶片表面蜡质晶体形态进行了观察。结果表明,节节麦叶表皮蜡质经GC-MS分析,共鉴定出化合物21种,主要以初级醇为主(苗期、抽穗期和灌浆期相对含量分别为85%、84%和70%),并含有少量的烷烃、醛、酮和脂肪酸;随着节节麦的生长发育,蜡质总量不断积累,烷烃含量极显著地升高,其中以C29烷烃的增加最明显,而初级醇含量显著降低,其中C26醇的相对含量降低最明显(苗期、抽穗期和灌浆期相对含量分别为80%、76%和63%),其他各类化合物组分变化不大。经扫描电镜观察,节节麦叶片近轴和远轴面的蜡质晶体形态无明显差别,苗期均为片状,抽穗期大部分仍以片状形态存在,并且蜡质晶体的密集程度比苗期稀疏,灌浆期蜡质晶体的密集程度变得更加稀疏。这些变化可能与抽穗期、灌浆期烷烃含量的增加和初级醇含量的减少有关。