山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

感染细胞与痘疹样本中山羊痘病毒PCR检测方法的建立

比较Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后,根据山羊痘病毒P32基因设计引物,建立了能检测感染细胞培养物与组织病料的PCR方法,结果显示以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量与纯度上均明显高于Trizol法;该PCR方法对山羊痘标准毒株细胞感染物能扩增出特异性的DNA条带,最小检出量为40.625ng;且能检出山羊痘疫苗毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA,而对鸡痘疫苗毒株感染细胞、正常细胞及正常山羊皮肤均为阴性反应。这些结果表明,建立的PCR方法具有特异性强、可靠性好、灵敏度高等特点,可用于山羊痘的临床诊断。     

产蛋下降综合征病毒DNA限制性酶切分析的研究

摘要：选用BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、HindⅢ等6种限制性内切酶对EDS两病毒内蒙古地区分离株(N3、B4)和参考株(AV-127)病毒基因组DNA进行酶切分析，均产生4，5，9，4，2和10条DNA片段，而且N3、B4株与参考株病毒基因组DNA之间的酶切图形、片段大小也十分相似，从分子水平上证实N3、B4株是EDS两病毒，同时也说明限制性内切酶分析法是检测EDS76病毒的一种简便快速的方法。     

牛传染性鼻气管炎病毒DNA的限制性酶切分析

分离自不同种、不同部位的6种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)毒株经限制罂内切酶 EcoRⅠ、HindⅢ、RstⅠ和 SmalⅠ消化分析后呈现3种酶切电泳图.2株分离自精液的病毒(美精株和洛精株)4种酶切电泳图完全相同;Bartha Nu/67株与美精株和洛精株仅在 EcoRⅠ酶切图谱上有微小差异(一个酶切位点的变化),其它3种酶切图也完全相同。分离自水牛的 B7株与其它5种病毒DNA 的酶切图谱差异十分显著。2株分离自呼吸道的病毒(IBR-125和 LA 侏)与其它几株病毒差异也较明显,但二者之间也有一定的差异。     

鸭瘟病毒基因组的提取和限制性酶切分析

利用高渗缓冲液裂解感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,加入核酸酶消化细胞DNA,再抽提病毒DNA的方法提取鸭瘟病毒基因组,结果证明,这种方法可以最大限度地消除细胞DNA的污染,得到纯净的病毒基因组DNA.用10种限制性内切酶对鸭瘟病毒疫苗株和分离株的基因组进行酶切分析,酶切产物电泳结果表明,Sma Ⅰ、Sal Ⅰ、Pst Ⅰ、Not Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ 7种限制酶产生酶切图谱二者几乎完全一致,EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ仅有个别条带不同,BglⅡ产生的条带迁移率差别较大,但条带数量相同.     

山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性

以贵州本地分离纯化的山羊痘病毒为试验材料,感染Vero细胞,通过台盼蓝、吖啶橙/溴乙锭荧光染色分析细胞的死亡及凋亡比例;经特异性PCR从山羊痘病毒基因组中分离出山羊痘病毒抗凋亡蛋白样基因,基因长531bp,含有完整的编码框,与绵羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的相似性为97%,因此确定为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。进一步研究山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因在Vero细胞中的表达,结果显示,病毒感染Vero细胞24h时没有检测到凋亡现象,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的mRNA水平最高;感染48h时,Vero细胞的凋亡率上升到13%,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量随之下降。结果表明,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量与Vero细胞的凋亡呈负相关,有助于病毒在细胞内的生存和侵染等过程。     

山羊痘弱毒疫苗株TK基因的克隆及序列分析

以提取的山羊痘弱毒疫苗株HLJ—V9 DNA为模板，设计特异性引物并进行PCR扩增，获得了2078bp的DNA片段，并将PCR产物克隆至pGEM—T Easy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明，成功获得了TK基因，获得的TK基因内存在一个Kpn Ⅰ酶切位点和编码区的早期转录终止信号TTTTTN（T）T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明，弱毒疫苗毒株HLJ—V9 TK基因与参考毒株的同源性在95．5％～100％之间，说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。     

山羊痘云南流行毒株的分离鉴定及P32基因PCR-RFLP分析

应用牛睾丸细胞,从12份采集自云南省不同疫点的山羊痘病羊肺脏中分离获得3株可疑毒株.这3株流行毒株经本动物回归试验、PCR鉴定及P32基因PCR-RFLP分析后确诊为山羊痘病毒,并据分离地被命名为MYS、XW、XD毒株.     

山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA复制非必需区的筛选

提取山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA，用HindⅢ酶切，随机克隆到pUC18质粒中，限制性内切酶片段电泳分析和序列测定结果表明，克隆到4个不同大小的HindⅢ片段pUA、pUB、pUC和pUD。随后，将它们和羊痘病毒Pellor（AY077835）株进行了同源性比较，发现核苷酸同源性为90。0％～94．5％，氨基酸同源性为83．0％～91．4％。选取克隆或亚克隆后的单一酶切位点，插入P11P7.5-LacZ报告基因，构建了pUAl、pUBl、pUCl和pUDl共4个重组载体质粒。通过脂质体分别转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞，在X-gal存在条件下经蓝白斑筛选重组病毒，获得1株重组病毒，证明筛选出了1个复制非必需区片段。     

山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR—RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位～652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp 1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739bp的目的片段后,再用限制性内切酶BsP1407 Ⅰ进行酶切分析。疫苗株可以切成135hp和604bp3个片段,广西分离株可以切成135、226、378bp3个片段。结果表明,所建立的PCR—RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。