马铃薯SRAP-PCR反应体系的优化

[目的]建立马铃薯大西洋SRAP—PCR反应体系,为今后的研究奠定基础。[方法]以马铃著大西洋基因组DNA为模板,从Mg^2＋浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA浓度5个方面对大西洋SRAP-PCR反应体系进行优化。[结果]适合大西洋的SRAP-PCR反应体系为：模板DNA1．0μl（50ng／μl）,Vaq酶1．7μl（1U／μl）,引物对1．5μl（1μmol／L）×2,MgCl2 2．4μl（25mmol／L）,dNTPs0．6μl（10mmol／L）,10×Buffer3．0μl,ddH2O18．3μl,总体积30μl。[结论]建立的SRAP-PCR反应体系是稳定可靠的。     

氯氰菊酯与DNA相互作用的光谱研究

[目的]对农药氯氰菊酯与DNA的相互作用进行研究,揭示其致畸的作用机制。[方法]在pH值7．4的‘蹦s．HCI缓冲溶液体系中,利用紫外吸收光谱法和荧光探针,对氯氰菊酯与DNA的结合方式和结合常数进行研究。[结果]氯氰菊酯在256nm处的紫外吸收峰随着DNA的加入发生了显著蓝移,同时吸光强度逐渐增大,DNA在203ntn处的紫外吸收峰随着氯氰菊酯的加入发生了显著红移,同时吸光强度逐渐降低,这说明氯氰菊酯与DNA形成了复合物;固定DNA浓度（3．4×10^-4moll／L）,改变氯氰菊酯浓度（1×10^-5 6×10^-5mol／L）,在203nm处测定吸光度,计算得到37℃时结合常数K为7．19×10^3L／mol;结合荧光探针试验证明氯氰菊酯与DNA是以沟槽方式结合。l结论I氯氰菊酯与DNA以沟槽方式结合可能是氯氰菊酯具有致畸作用的原因．     

辣木RAPD最佳反应体系的构建

[目的]研究辣木（Moringa oleifera Lamarch．）PAPD最佳反应体系,为辣木RAPD扩增提供研究基础。[方法]以辣木为研究材料,通过正交设计建立辣木RAPD最佳反应体系。[结果]辣木最佳RAPD反应体系为：10×PCR Buffer 2．5μl,Taq酶0．5μl（2．0U／μl）,dNTPs4．0μl（2．0mmol／L）,primer 4．0μl（2．0μmol／L）,DNA2．0μl（30．0ng／μl）,ddH2O 12．0μl;反应总体积为25．0μl。[结论]RAPD可以应用于辣木研究。     

以氧化铟锡为导电基体材料构建新型全固态铵离子选择电极及其应用

[目的]建立一种快速检测铵离子的方法。[方法]以氧化铟锡为导电基体材料构建新型的全固态铵离子选择电极,并研究其应用效果。[结果]该电极检测铵离子的线性范围在1×10-4~1×10-1mol/L,响应斜率为(43.8±0.1)m V/dec,检测下限为3.27×10-5mol/L。[结论]该电极响应时间较快,且具有较强的稳定性和抗干扰能力,适用于水及废水中铵的测定。     

基于普鲁士蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器

以铂电极为基底,用恒电位沉积一层普鲁士蓝（PB）,然后用纳米金和明胶构成的复合固酶基质,结合溶胶-凝胶技术将辣根过氧化物酶（HRP）固定在普鲁士蓝修饰的电极表面,再用戊二醛（GA）对复合酶膜进行交联改性,从而制备了性能良好的过氧化氢传感器,采用循环伏安法（CV）、计时电流法、交流阻抗法（EIS）对传感器进行了电化学表征。在pH=6.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中,探讨了工作电位、pH、温度以及干扰物质对传感器响应电流的影响。实验结果表明,此方法有较高灵敏度、较好抗干扰能力、良好稳定性及重现性。传感器对H2O2的线性响应范围为1．2×10^-6～1．3×10^-3mol／L,检测限为6．0×10^-7mol／L。     

基于FePz(dtn)4和纳米金固定辣根过氧化物酶生物传感器的研究

在玻碳电极上电沉积四（1,4-二噻英）四氮杂卟啉铁（FePz（dtn）t）,将其作为电子媒介体与纳米金结合,利用纳米金的比表面积大,吸附能力强等优点固定辣根过氧化物酶,最后用聚乙烯缩丁醛包埋修饰好的电极,制备了过氧化氢传感器．采用循环伏安法考察了传感器的电化学特性,以-0．25V为工作电位,在pH=6．5,温度为25℃的最佳条件下,其峰电流值与H2O2浓度在3．5×10^-6～7．35×10^-3mol／L成良好的线性关系,检测下限为1．0×10^-6mol／L（S／N=3）．该传感器有非常好的稳定性,响应较快、灵敏度较高,且具有良好的选择性．     

正交设计优化稻瘟病菌SSR-PCR反应体系

[目的]筛选最佳的稻瘟菌SSR—PCR反应体系。[方法]利用正交设计对稻瘟菌SSR—PCR反应体系中的5个因素（TaqDNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP、引物）在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平并进行退火温度梯度试验筛选最佳的退火温度。[结果]稻瘟菌SSR-PCR反应的最佳体系为：反应总体积为20μl,raqDNA聚合酶1．0U,Mg^2＋ 2．0mmol／L,DNA100ng,dNTP50la,mol／L,引物（ms355～356）0．4μmol/L,最佳退火温度为58．5℃。在此体系下可从稻瘟菌材料基因组DNA中扩增出300bp左右清晰的目的条带,说明该体系稳定,适用于稻瘟菌基因组DNA的SSR标记。[结论]该研究为稻瘟菌的分子标记、遗传多样性研究和分子育种奠定了基础。     

麻疯树cpSSR标记技术的建立与体系优化研究

[目的]建立麻疯树cpSSR—PCR反应的最佳反应体系。[方法]对影响麻疯树cpSSR—PCR反应体系的5个因素（细DNA聚合酶、DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物）进行优化试验,筛选各反应因素的最佳水平。[结果]20山反应体系各组分的最合适浓度分别为10XBuffer、2．00mmoL／LMg2＋、2U／μlTagDNA聚合酶、0．2mmol／LdNTP、0．2μmol／L引物、35ng／μlDNA模板。[结论]最佳的退火温度为52℃：该反应体系的稳定性和可重复性均较好。     

加标浓度直读法快速测定大蒜中微量氟的研究

[目的]建立一种快速测定食品中微量氟的新方法。[方法]用超声波浸提法提取大蒜中的氟离子,利用离子选择性电极在加入标准溶液后直接读取样品液的氟浓度。[结果]大蒜的水分含量平均值为77．730％,其RSD为2．1％。各因素对样品液氟含量的影响依次为：超声温度〉料液比〉超声时间,大蒜氟离子的最佳提取工艺：料液比为0．5：25．0,在25℃下超声提取3min。氟电极的斜率转换系数为97．9％。试验测得样品液氟含量的平均值为29．076μg／g,其RSD为2．6％。在测定样品液氟含量条件下,10．00μmol／L氟标准液氟含量的平均测定值为9．875μmol／L,相对误差为-1．25％。[结论]利用离子选择性电极,结合加标浓度直读法与超声波浸提技术快速测定大蒜中微量氟的方法简便、直观,适用于现场快速测定。     

"循化红"线辣椒SRAP-PCR反应体系的优化与建立

[目的]建立适合于“循化红”线辣椒基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系。[方法]采用L16（4^5）正交试验设计,对“循化红”线辣椒SRAP反应体系中的Mg^2＋浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行5因素4水平正交优化。[结果]“循化红”线辣椒的最佳SRAP—PCR反应体系为：Mg^2＋浓度为2．0mmol／L,dNTPs为0．5mmol／L,Taq酶0．5U,引物浓度为0．4μmol／L,模板DNA浓度为1．0ng/μl,总体积20μl。[结论]该体系的建立为SARP标记技术应用于“循化红”线辣椒种质资源的收集与利用,品种的鉴定、标记辅助育种等方面奠定了良好的试验基础。     

SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化

[目的]研究SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化。[方法]采用交互正交设计L27（313）对苦荞SRAP-PCR反应体系进行了5因素（Mg2＋、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物）3水平优化筛选,比较了非变性和变性PAGE检测方法,并进行了DYCZ-24F与DYCZ-20C2种电泳操作系统的对比试验。[结果]4个单因素（Mg2＋、dNTP、Taq酶和引物）和2个交互作用（Mg2＋×dNTP、Mg2＋×Taq酶）对苦荞SRAP-PCR有极显著影响;最佳反应体系为：20μl总体积,Mg2＋1.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,Taq酶1.5U,模板DNA40ng,引物0.25μmol/L,10×缓冲液2μl。运用该体系对7份苦荞材料进行扩增,扩增条带清晰、多态性高、重复性好。将扩增产物进行非变性与变性PAGE和2种电泳操作系统检测,结果显示非变性PAGE、DYCZ-24F操作系统更适合于SRAP的分析。[结论]为今后构建苦荞SRAP遗传图谱奠定了基础。     

细菌过氧化氢酶基因的克隆方法研究

[目的]研究细菌过氧化酶基因的克隆方法。[方法]培养扩增E.coli W3110,提取其基因组DNA,采用限制性内切酶Sau3A I对其进行部分酶切,分离纯化1.5 kb以上的DNA片段。将经BamH I酶切的大肠杆菌质粒pUC18与经Sau3A I部分酶切的不同片段用T4连接酶进行连接,并转化大肠杆菌DH5α。通过BHI-单宁酸培养介质,筛选出含有活性过氧化氢酶基因的重组子。[结果]经酶切和PCR鉴定,证实所克隆的过氧化氢酶基因是正确的,与理论相符。[结论]该研究结果为快速简便地克隆筛选活性细菌过氧化氢酶基因奠定了基础。     

铬胁迫对小麦幼苗叶片DNA含量的影响

[目的]研究Cr6＋对小麦幼苗叶片DNA含量的影响。[方法]用5~100 mg/LCr6＋分别处理3和10 d龄小麦幼苗,紫外分光光度法和电泳法测定DNA含量变化。[结果]Cr6＋处理的小麦幼苗叶片DNA含量显著降低,3 d龄幼苗叶片DNA含量的下降幅度大于10 d龄幼苗。电泳图谱表明,对照叶片DNA带基本完整,而Cr6＋处理的DNA则发生了降解,出现拖尾现象。[结论]Cr6＋处理减少了小麦幼苗叶片DNA含量,进而影响其正常生长。6＋     

Cr6+胁迫下小麦幼苗地上部分生长及DNA损伤效应的研究

[目的]阐明Cr6+影响小麦幼苗生长发育的毒理机制。[方法]研究5~100 mg/LCr6+胁迫72 h对3 d和10 d龄小麦幼苗地上部分生长的影响及DNA损伤效应。[结果]5~100 mg/LCr6+均表现出降低两苗龄幼苗苗高、地上部分鲜重、干重的效应;3 d龄幼苗比10 d龄幼苗对Cr6+胁迫更敏感;Cr6+导致小麦幼苗叶片DNA含量显著降低,3 d龄幼苗叶片DNA含量下降的幅度大于10 d龄幼苗;5~100mg/LCr6+均引起3 d和10 d龄幼苗地上部分DNA的增色效应值高于对照值。[结论]Cr6+造成的DNA损伤可能是影响不同龄期小麦幼苗生长的主要原因之一。     

重金属铬对小麦DNA甲基化水平的影响

[目的]研究Cr6＋对小麦幼苗DNA含量和DNA胞嘧啶甲基化的影响。[方法]用浓度5~100 mg/L Cr6＋分别处理3和10 d龄小麦幼苗后,以CTAB法提取叶片和根系DNA,用紫外分光光度法测定DNA含量,高效液相色谱法进行5-甲基胞嘧啶百分含量的测定。[结果]Cr6＋导致小麦幼苗叶片和根系DNA含量显著降低,其中根系DNA含量下降的幅度大于叶片;3 d龄幼苗叶片和根系DNA含量下降的幅度大于10 d龄幼苗。除浓度100 mg/L Cr6＋导致3 d龄幼苗根系DNA胞嘧啶甲基化水平的降低外,所试浓度Cr6＋均引起了3和10 d龄小麦幼苗叶片和根系DNA胞嘧啶甲基化水平的升高。[结论]Cr6＋处理引起不同苗龄小麦幼苗DNA含量和DNA胞嘧啶甲基化水平的改变,可能是影响小麦幼苗正常生长的原因。     

8种水稻基因组DNA提取方法的比较

[目的]寻找操作简便、耗时短、成本低的水稻基因组DNA提取方法。[方法]分别以水稻幼嫩黄化叶片和老叶片为材料,用8种方法提取其中的DNA,测定所提DNA的浓度和纯度,并对其进行PCR扩增和电泳检测,比较各方法的提取效果。[结果]8种方法提取的DNA浓度分别为35.15、30.80、67.30、26.15、23.55、8.95、48.05、54.26μg／ml,方法③提取的DNA浓度最大,但PCR扩增效果较差;改进的SDS法（方法⑦、⑧）提取的DNA纯度较高,PCR扩增产物电泳条带较亮,但这2种方法操作程序复杂,成本较高,提取每份样品的成本分别为14、31元,远高于其他提取方法。[结论]除方法③外,其余5种简化方法均能得到较高质量的水稻基因组DNA,且提取成本远低于传统SDS法。     

ETR1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。     

几种食用菌子实体总DNA提取方法的比较研究

[目的]比较选择适宜的不同食用菌子实体总DNA的提取方法。[方法]采用CTAB法、SDS法和CTAB-SDS结合法,对5种食用菌子实体[平菇（Pleurotus ostreatus）、香菇（Lentinula edodes）、金针菇（Flammlina velutiper）、羊肚菌（Morehella esallenta）和北虫草（Cordyceps sinensis）]总DNA进行提取,并用琼脂糖凝胶电脉进行检测。[结果]在几种提取方法中,平菇与金针菇宜采用SDS常温离心提取法,香菇宜采用SDS低温离心提取法,北虫草宜采用SDS-CTAB低温离心提取法,羊肚菌宜采用CTAB常温离心提取法和SDS常温离心提取法。[结论]该研究可为几种食用菌子实体的分子水平和基因工程研究奠定基础。     

盐藻DNA对水稻幼苗在低盐中生长的影响

[目的]分析盐藻DNA对水稻幼苗在低盐中生长的影响。[方法]将刚萌发的水稻幼苗根系浸入5 mg/L盐藻DNA溶液中培养2d,以蒸馏水培养为对照,处理后的水稻幼苗栽于含有氯化钠3 g/L的MS培养液中培养,分析盐藻DNA对水稻幼苗在低盐中生长的影响。[结果]水稻幼苗用5 mg/L盐藻DNA处理后,在含氯化钠3 g/L的MS培养液中培养15 d,其平均株重为150.7 mg,比对照增加了10.3%;平均株高为15.28 cm,比对照增加了6.1%;平均存活率为45.0%,比对照增加了125.0%;平均根数为7.15条,比对照减少了2.8%;平均根长为3.83 cm,比对照缩短了8.4%。说明盐藻DNA提高了水稻幼苗的耐盐适应性。[结论]盐藻DNA可提高水稻的耐盐适应性。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。