桑叶提取物的抗病毒活性检测

桑叶作为中药或功能饮品的重要成分在民间和临床上广泛应用。用70%乙醇对广东桑、白桑、鸡桑、鲁桑等桑种共20个品种的桑叶进行浸提,并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同萃取组分及剩余水相组分。利用细胞病变减少法(CPE法)检测发现多个桑叶样品的萃取组分或水相组分含有抗病毒活性物质,且抗病毒活性具有选择性。其中,能有效抑制单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的样品最多,6个桑品种桑叶的乙酸乙酯萃取组分对HSV-1的半数抑制浓度(IC50)≤12.5μg/mL;广东桑品种桑叶的水相组分和石油醚萃取组分具有较高的抗甲型流感病毒(Flu A)活性;部分桑品种桑叶的萃取组分对登革病毒2型(DV2)也有一定的抑制活性;20个桑品种桑叶的4种萃取组分对柯萨奇B3病毒(CVB3)均无抑制活性。上述结果表明桑叶含有丰富、较为广谱的抗病毒活性成分,但不同桑品种间的桑叶化学成分及抗病毒活性有一定差异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通过降解IκBα激活NF-κB信号通路

核转录因子κB(NF-κB)在调节细胞免疫功能及细胞增殖和存活方面均发挥着重要的作用。本研究采用高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒(HP-PRRSV)GD08-1株和经典株PRRSV GD-XH分别感染Marc-145细胞,于感染后不同时间提取胞浆蛋白和核蛋白,通过电泳迁移率(EMSA)检测NF-κB与DNA结合活性及western blot检测胞浆蛋白中NF-κB及其抑制因子(IκB)的表达情况。HP-PRRSV株和PRRSV经典株感染Marc-145核蛋白的EMSA结果中均出现NF-κB与DNA探针的结合条带;western blot结果表明,HP-PRRSV株和PRRSV经典株感染Marc-145细胞并未引起NF-κB表达量的变化,但两者均引起了IκB表达水平的下降,由此推测,HP-PRRSV株和经典PRRSV株感染均能够刺激Marc-145细胞NF-κB活化入核内,PRRSV感染Marc-145细胞引起的NF-κB的活化是通过IκB的降解来实现的。     

MCPIP1在抑制流感病毒诱导宿主抗病毒免疫应答中的作用

单核细胞诱导蛋白1(monocyte chemotactic induced protein1,MCPIP1)是近年来发现的一种重要的免疫应答负向调控蛋白。为了研究MCPIP1对A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染诱导的宿主抗病毒免疫应答的调控作用,我们首先证实了IAV感染A549细胞内MCPIP1的表达量显著上调。随后,在A549细胞中进行MCPIP1的过表达和表达抑制后利用Western blot方法检测了其对IAV感染诱导的细胞内NF-κB信号通路活化的影响。结果表明,过表达MCPIP1抑制了病毒诱导的NF-κB的活化,反之,抑制内源性MCPIP1的表达时则明显促进了NF-κB的激活。进一步研究发现MCPIP1可抑制NF-κB信号通路下游宿主抗病毒和促炎因子的表达,如TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-6等。由此推测,IAV可以通过诱导宿主MCPIP1的表达以抑制机体的抗病毒免疫应答。     

PrP106-126诱导的小鼠成神经瘤N2a细胞NF-κB激活及神经毒性研究

PrP106-126诱导的神经毒性机制仍不清楚。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用WesternBlot方法首次发现PrP106-126导致核转录因子NF-κB的亚单位p65蛋白转移到细胞核内,激活了NF-κB细胞信号分子。转核抑制剂NF-κB SN50预处理细胞减弱了PrP106-126诱导的NF-κB激活程度;并且DNA Ladder凋亡检测及Annexin V-FITC和PI双染流式细胞凋亡检测发现,NF-κB SN50能够抑制p65蛋白转核,在一定程度上也抑制了PrP106-126对N2a细胞的神经毒性效果。结果表明NF-κB信号分子参与了PrP106-126的神经毒性,且NF-κB信号分子的激活对N2a细胞具有促凋亡作用。PrP106-126激活N2a细胞NF-κB信号分子以及NF-κB促凋亡功能的体外研究对于阐明朊病毒病致病机理具有重要意义。     

TLR信号途径对于NF-κB活化的调控及作用机制

Toll样受体家族(TLRs)作为一类重要的传感器可以识别多种微生物成分并引起固有免疫应答。转录因子的活化可以调节对TLR应答基因的诱导,而其中最为重要的是核转录因子-κB(NF-κB),一种可被所有TLRs所作用的转录因子,TLR可经由不同途径活化NF-κB,活化后的NF-κB可调控大量与免疫应答和与细胞凋亡及分化相关的目的基因。本文就经由TLR所介导活化的NF-κB过程中的分子途径、蛋白调控方式及免疫学效果作简要综述。     

痘病毒编码的蛋白对NF-κB信号通路调控作用研究进展

NF-κB是一种对免疫系统调节起关键性作用的核转录因子,且NF-κB信号通路是痘病毒家族抑制和逃避宿主免疫应答的主要靶点。目前已证实,痘病毒具有独特的调节宿主免疫应答过程的能力,特别是痘病毒科编码的蛋白通过影响与宿主天然免疫密切相关的NF-κB信号通路,有利于病毒在宿主细胞内的复制,导致病毒不断地逃逸免疫保护而出现病毒的反复感染。因此探索痘病毒科编码的蛋白调节NF-κB信号通路的机制已成为目前研究的热点。文章主要综述了近些年痘病毒编码的蛋白通过不同的途径调节NF-κB信号通路的调控作用,为进一步对宿主细胞早期抗病毒的免疫应答方面的研究奠定基础。     

重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF-κB信号通路的影响

采用重组RTB蛋白刺激RAW264.7细胞,对iNOS、IL-6和TNF-αmRNA表达及IκB-α和NF-κBp65磷酸化蛋白表达进行分析,探讨重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF-κB信号通路的影响。结果显示,重组RTB蛋白组RAW264.7细胞iNOS、IL-6和TNF-αmRNA的表达显著高于对照组(P<0.01),并呈现时间和计量依赖性;加入NF-κB抑制剂BAY后,iNOS、IL-6和TNF-αmRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)。随RTB刺激RAW264.7时间的延长,IκB-α蛋白的磷酸化程度增强,NF-κBp65磷酸化蛋白表达逐渐增高,表明重组RTB蛋白具有促进巨噬细胞活化及活化NF-κB信号通路的功能。     

病毒感染与细胞核转录因子-κB信号转导的相互作用关系

自发现细胞核转录因子-κB(NF-κB)以来,人们对其分子生物学特征、作用机制及其与疾病的关系作了广泛的研究。近年来的研究结果发现,NF-κB在病毒感染与疾病发生的过程中发挥着重要作用。病毒感染真核细胞时能诱导NF-κB从细胞质转移到细胞核,从而诱导一些炎性基因转录产生大量炎性因子引起炎症反应,或阻碍细胞凋亡促进其自身在宿主细胞内的复制,或促进某些原癌基因的表达使细胞癌化等。不同病毒感染机体时,都会通过对NF-κB信号转导的影响,改变机体的某些性状,导致疾病的产生。目前已发现应激刺激、细菌脂多糖、病毒、氧自由基等很多因素能激活NF-κB,而后通过NF-κB信号转导通路的桥接作用影响机体的新陈代谢,文章就病毒感染与细胞NF-κB信号转导的相互作用关系作一综述。     

A型流感病毒NS1蛋白的结构与功能

A型流感病毒片段8编码的NS1蛋白是病毒复制和传播的重要调节蛋白。它含有3个功能区,即RNA结合区,eIF4GI结合区和效应区。NS1蛋白在A型流感病毒感染细胞中高水平表达,它的主要功能是抑制NF-κB(nuclear factor-κB)活化和IFN(inter-feron)-α/β介导的抗病毒作用,抑制Jun N末端激酶(jun N-terminal kinase,JNK)和AP-1(activating posttranslation)转录因子活化;下调病毒感染细胞凋亡;促进病毒基因表达,抑制宿主mRNA加工和转运。NS1蛋白的深入研究,为今后预防和治疗A型流感病毒寻找突破口。     

氧化应激对PRRSV致PAM细胞TLR3/NF-κB分子转录的影响

为探讨氧化应激对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)TLR3/NF-κB信号分子转录的影响,体外分离培养PAM,分为对照组、PRRSV感染组、抗氧化剂NAC+PRRSV组,促氧化剂H2O2+RRRSV组。分别在培养6、12、24、48、72h收集细胞,观察各组的细胞病变、real-time PCR检测PRRSV、TLR3、TRIF和NF-κB mRNA转录量的变化。结果显示,PRRSV感染组PRRSV、TLR3、TRIF及NF-κB mRNA的转录量与对照组相比随感染时间的延长显著升高(P0.05),48h达到最大值;NAC处理接毒组各信号分子mRNA的转录量比PRRSV感染组同时间点略低;H_2O_2处理接毒组比PRRSV感染组的略高。结果表明,氧化应激可增强PRRSV致PAM细胞TLR3/NF-κB分子mRNA的转录量,NF-κB的活化可能是PRRSV导致细胞损伤的机制之一。     

猪非典型瘟病毒云南株Mut蛋白的特征分析及其对宿主细胞NF-κB转录活化的影响

猪非典型瘟病毒(APPV)是近年来新发现的猪病毒性病原，给养猪业健康发展带来了严重的威胁。课题组前期研究发现了APPV云南株(APPV-YN)导致感染猪临床症状非典型化的关键基因Mut,为探讨APPV-YN Mut的生物学特征及其对宿主细胞NF-κB信号通路转录活化的影响，揭示APPV非典型化的机制。利用SnapGene、ProtParam、PredictProtein、TMHMM、SignaIP 4、ProtScale等在线软件对APPV-YN Mut基因表达蛋白的理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点等进行分析预测；将重组载体pCMV-Mut转染至HEK-293细胞，确定蛋白稳定表达后利用TNF-α刺激NF-κB信号通路使其活化，分析APPV-YN Mut对NF-κB转录活性及其对NF-κB P65核质转运的影响。生物信息学分析结果显示，Mut蛋白为亲水性的稳定蛋白，无跨膜结构和信号肽，可能主要定位于细胞质，二级结构主要以无规则卷曲为主，三级结构稳定，可能作用于PKC、P38MAPK、PKA、EGFR、CDK5等相关激酶及蛋白受体；Mut蛋白在HEK-293细胞成功表达，大小约为15 k...     

芹菜素通过NF-κB和MAPK通路抑制MAC-T细胞和小鼠乳腺的炎性反应

为揭示芹菜素对奶牛乳腺炎的抑制作用及其机制,本研究采用脂多糖(LPS)刺激MAC-T细胞,MTT方法检测芹菜素对奶牛乳腺上皮细胞MAC-T的毒性;real-time PCR和Western blot方法检测炎性因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及氧化应激因子诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶2(COX-2)的表达水平;Western blot检测核因子κB(NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键蛋白的表达水平和磷酸化水平;免疫荧光检测NF-κB的核转移情况。结果表明：芹菜素(1,7,15 mg/L)显著降低了MAC-T细胞和小鼠乳腺中LPS诱导的COX-2、iNOS、IL-1β、IL-6的mRNA与蛋白质的表达水平(P<0.01)。而且,芹菜素显著降低了MAC-T细胞以及小鼠乳腺中LPS诱导的NF-κB(p65和IκBα)(P<0.05)和MAPK(p38、JNK1/2和ERK1/2)(P<0.01)的磷酸化水平,抑制了NF-κB p65的核转移。这些结果说明芹菜素通过抑制NF-κB和MAPK信号...     

冷诱导RNA结合蛋白通过激活NF-κB信号通路影响H1N1甲型流感病毒的复制

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是NF-κB和ERK信号通路的上游调控因子,而这两条信号通路是甲型流感病毒复制和机体起始免疫所必需的,为探讨CIRP对H1N1甲型流感病毒复制的影响及可能的分子机制,构建了CIRP过表达BHK-21细胞系(Cirp+BHK-21),用Western blot检测NF-кB和ERK1/2的磷酸化水平,研究CIRP对NF-кB和ERK1/2的调节作用;用Real-time RT-PCR检测H1N1甲型流感病毒感染后Cirp+BHK-21和对照细胞中病毒拷贝数的动态变化,以及在特异性阻断剂PDTC阻断NF-кB通路的Cirp+BHK-21细胞中病毒拷贝数的动态变化。Western blot检测结果显示:过表达CIRP显著促进了BHK-21细胞中NF-κB的磷酸化水平(P0.05),而对ERK1/2的磷酸化水平无显著影响;病毒定量检测结果显示:过表达CIRP能显著促进H1N1甲型流感病毒的增殖,感染后3、9、15、21h病毒在Cirp+BHK-21细胞中的拷贝数分别为对照组的111%、103%、167%和235%(P0.05);阻断NF-κB信号通路后病毒的拷贝数显著下降,在感染后3、9、15、21h分别为未阻断组的98%、42%、19%(P0.05)和7%(P0.05)。从本研究结果可见,CIRP可通过活化NF-κB信号通路促进H1N1甲型流感病毒的复制。     

重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF—κB信号通路的影响

采用重组RTB蛋白刺激RAW264．7细胞,对iNOS、IL-6和TNFJamRNA表达及IκB-α和NF-κBp65磷酸化蛋白表达进行分析,探讨重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF-xB信号通路的影响。结果显示,重组RTB蛋白组RAW264．7细胞iNOS、IL-6和TNF—αmRNA的表达显著高于对照组（P〈0．01）,并呈现时间和计量依赖性;加入NF—κB抑制剂BAY后,iNOS、IL-6和TNF0amRNA表达降低（P〈0．05或P〈0．01）。随RTB刺激RAW264．7时间的延长,IκB-α蛋白的磷酸化程度增强,NF-κBp65磷酸化蛋白表达逐渐增高,表明重组RTB蛋白具有促进巨噬细胞活化及活化NF-κB信号通路的功能。     

黄连水提物对LPS诱导的猪肠道上皮细胞IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达及NF-κB/MAPK信号通路的调控作用

为探讨中药黄连对LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性免疫反应及其信号通路的调控机制,以猪肠道上皮细胞IPEC-J2作为研究对象,MTT法检测不同质量浓度黄连水提物及LPS对猪肠道上皮细胞活性的影响。用0.1,0.5,5.0 g/L黄连水提物预处理猪肠道上皮细胞,再经LPS(5 mg/L)作用1 h后,Real-time PCR法检测促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-ɑmRNA的表达水平,并用Western blot法检测NF-κB/MAPK信号通道关键蛋白表达情况。结果显示,5 mg/L LPS可诱导猪肠道上皮细胞IL-1β、IL-6、TNF-ɑmRNA的表达水平极显著升高(P<0.01),而经黄连水提物预处理的猪肠道上皮细胞的相关炎性细胞因子的表达水平则出现下降,且与药物质量浓度呈正相关;LPS可有效激活猪肠道上皮细胞NF-κB/MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化和表达,而黄连水提物则可有效降低细胞IκB、p-IκB、p65、p-p65、p-p38、JNK等蛋白的表达,达到抑制NF-κB/MAPK信号通路的传导和调控LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性反应的作用。结果表明,黄连水提物可通过抑制NF-κB/MAPK信号通路的活化及其下游促炎性细胞因子的表达,起到调控LPS诱导的猪肠道上皮细胞炎性反应的作用。     

漏芦通过TLR4/NF-κB通路抑制脂多糖诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应

为探讨漏芦醇提物（RUEE）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠乳腺上皮细胞（HC11细胞）的抗炎作用及机制,试验利用RUEE(80μg/mL)、LPS(1μg/mL)单独处理以及RUEE(80μg/mL)+LPS(1μg/mL)共处理HC11细胞,采用荧光定量PCR检测炎性细胞因子及Toll样受体4(TLR4)mRNA表达水平,采用Western blotting检测核转录因子κB(NF-κB)通路关键因子的蛋白表达量。结果表明：LPS诱导可明显提高HC11细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、环氧合酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表达水平（P<0.05）;明显上调TLR4 mRNA表达及NF-κB p65和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的磷酸化水平（P<0.05）。RUEE预处理可显著降低LPS诱导的HC11细胞TNF-α、COX-2、IL-6、IL-1β的mRNA表达（P<0.05）;显著下调TLR4 mRNA表达及NF-κB p65和IκBα的磷酸化水平（P<0.05）。由此可知漏芦醇提物可通过抑制TLR...     

黄芪总黄酮对巨噬细胞RAW264.7抗炎免疫的双向调节研究

为研究黄芪总黄酮(TFA)对巨噬细胞RAW264.7的抗炎免疫双向调节作用,本研究首先采用MTT法筛选TFA对RAW264.7细胞的安全剂量;后续研究均采用以下两种方式开展:采用不同安全剂量(10μg/mL、25μg/mL、100μg/mL)的TFA与正常培养的RAW264.7细胞作用;上述不同浓度的TFA与RAW264.7细胞作用后以终浓度为1μg/mL LPS刺激。分别通过ELISA和RT-PCR检测上述两种情况下RAW264.7细胞中细胞因子的含量及其mRNA的转录水平;采用western blot测定上述两种情况下RAW264.7细胞NF-κB信号通路中关键蛋白的表达水平。结果显示,TFA在0～150μg/mL对细胞无明显毒性;ELISA和RT-PCR结果显示,TFA能够显著提高正常培养的RAW264.7细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量及其mRNA转录水平,抑制LPS刺激的RAW264.7细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的过度表达及其mRNA水平的过度转录,并呈剂量依赖性;western blot结果表明,TFA能够显著下调正常培养的RAW264.7细胞中IKKα/β、IκBα和C-NF-κB p65蛋白表达而上调p-IKKα/β、p-IκBα和N-NF-κB p65蛋白的表达,促进LPS刺激的RAW264.7细胞中IKKα/β、IκBα和C-NF-κB p65蛋白表达而抑制p-IKKα/β、p-IκBα及N-NF-κB p65蛋白的过度表达,并呈剂量依赖性。上述结果表明,TFA可分别通过调节正常和LPS刺激的RAW264.7细胞中关键蛋白的表达,适度活化NF-κB信号通路和抑制NF-κB信号通路的过度激活,提高正常培养的RAW264.7细胞细胞因子含量及mRNA转录水平,抑制LPS刺激的RAW264.7细胞促炎因子含量及mRNA水平的过度转录,从而发挥其抗炎免疫双向调节作用。本研究为TFA的临床应用提供参考依据和抗炎免疫药物的研发奠定基础。     

奶牛子宫内膜炎对子宫平滑肌收缩相关调控分子的影响

为了探讨奶牛子宫内膜炎发生对于子宫平滑肌收缩的影响,以及炎症对于子宫平滑肌收缩相关调控分子的影响,试验选取健康及子宫内膜炎患病荷斯坦奶牛各10头,分别作为健康组和患病组,对核因子κB(NF-κB)信号通路分子NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、NF-κB p65蛋白(NF-κB p65)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路分子p38、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和应激活化蛋白激酶(JNK)及蛋白磷酸化进行检测,对炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6]分泌情况及平滑肌收缩关键调节分子[RhoA、Rho激酶(ROCK)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、肌球蛋白轻链(MLC)、钙离子]进行检测并分析。结果表明:与健康组奶牛比,患病组奶牛子宫内膜组织IκBα、NF-κB p65、p38、ERK、JNK磷酸化蛋白水平显著升高(P0.05);TNF-α、IL-1β、IL-6促炎因子分泌量显著增加(P0.05);子宫平滑肌组织细胞内钙离子浓度显著下降(P0.05),RhoA,ROCK、MLCK表达量下降,MLC磷酸化水平降低。说明奶牛子宫组织炎症不仅损伤黏膜组织,而且还会对子宫平滑肌造成破坏,显著抑制子宫平滑肌收缩。     

植物多糖通过核因子κB及丝裂原活化蛋白激酶/核因子E2相关因子2信号通路发挥抗氧化作用的机制

植物多糖是植物提取物中重要活性成分之一,具有抗氧化、免疫增强、抗肿瘤等多种生物学作用。在抗氧化作用方面,植物多糖通过核因子κB(NF-κB)信号通路减少炎症因子的分泌,缓解氧化应激损伤;通过丝裂原活化蛋白激酶/核因子E2相关因子2(MAPK/Nrf2)信号通路清除机体或细胞内自由基,提高抗氧化酶活性或含量,增强机体或细胞对氧化应激的抗性。本文主要综述了氧化应激产生的原因及其危害,并阐述NF-κB及MAPK/Nrf2信号通路在植物多糖发挥抗氧化作用中的研究现状以及存在问题,为植物多糖作为抗氧化剂的研究与应用提供理论参考。     

口蹄疫病毒前导蛋白酶抑制宿主先天性免疫应答的机制

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病.口蹄疫病毒有多种机制对抗宿主的先天性免疫应答,在这个过程中病毒的前导蛋白酶(L^pro)发挥了关键作用.L^pro可切断宿主细胞帽子依赖性的蛋白翻译,抑制干扰素蛋白的合成;L^pro通过破坏核转录因子-κB (NF-κB)的完整性或减少干扰素调节因子3/7(IRF3/7)的表达,从而抑制IFN mRNA的产生;L^pro还会参与维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、TANK结合激酶1(TBK1)、TNF受体相关因子3(TRAF3)和TRAF6的去泛素化,从而影响Ⅰ型干扰素信号通路的活化.