基于DNA条形码的桑黄真菌分子鉴定

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种利用生物基因组内短遗传标签进行分类鉴定的方法。桑黄自古以来是一种名贵中药材,而市售桑黄主要依托简单的形态鉴定造成混淆众多。近年来大量研究表明,桑黄类真菌种类至少有7个种,并且其药效也不尽相同。【目的】为更准确、高效对桑黄类真菌进行鉴定,本研究以采集自西藏、吉林和浙江的3种桑黄子实体为材料,筛选最佳DNA条形码与相应PCR条件。【方法】利用组织分离获得3种桑黄纯培养菌株,分别编号为1713、1714和HS菌株。利用ITS、NL、rpb1、rpb2和ef1-α等7组DNA条形码分别对3种桑黄进行PCR扩增、测序、比对和发育树分析,并结合形态学特征,确定其最适DNA条形码和分类学地位。【结果】结果表明,ITS和NL条形码对3种桑黄均能够获得单一目的条带;rpb1Y、rpb2B和rpb2Y条形码特异性低,扩增后获得多个条带;而rpb1B和ef1-α条形码均无法获得条带。通过多序列比对,结合形态分析,确定1713菌株为桑黄纤孔菌(Inonotus sanghuang),而1714和HS菌株均为鲍姆纤孔菌(Inonotus baumii)。【结论】本研究确定ITS和NL为桑黄分子鉴定的最佳DNA条形码,其PCR最适退火温度范围分别为58~59℃和49~50℃,为桑黄真菌快速鉴定提供参考依据。     

基于DNA条形码的桑黄真菌分子鉴定

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种利用生物基因组内短遗传标签进行分类鉴定的方法。桑黄自古以来是一种名贵中药材,而市售桑黄主要依托简单的形态鉴定造成混淆众多。近年来大量研究表明,桑黄类真菌种类至少有7个种,并且其药效也不尽相同。【目的】为更准确、高效对桑黄类真菌进行鉴定,本研究以采集自西藏、吉林和浙江的3种桑黄子实体为材料,筛选最佳DNA条形码与相应PCR条件。【方法】利用组织分离获得3种桑黄纯培养菌株,分别编号为1713、1714和HS菌株。利用ITS、NL、rpb1、rpb2和ef1-α等7组DNA条形码分别对3种桑黄进行PCR扩增、测序、比对和发育树分析,并结合形态学特征,确定其最适DNA条形码和分类学地位。【结果】结果表明,ITS和NL条形码对3种桑黄均能够获得单一目的条带;rpb1Y、rpb2B和rpb2Y条形码特异性低,扩增后获得多个条带;而rpb1B和ef1-α条形码均无法获得条带。通过多序列比对,结合形态分析,确定1713菌株为桑黄纤孔菌(Inonotus sanghuang),而1714和HS菌株均为鲍姆纤孔菌(Inonotus baumii)。【结论】本研究确定ITS和NL为桑黄分子鉴定的最佳DNA条形码,其PCR最适退火温度范围分别为58~59℃和49~50℃,为桑黄真菌快速鉴定提供参考依据。     

野生桑黄的分离鉴定及培养特性研究

【目的】对浙江地区采集的野生桑黄菌株进行鉴定和系统发育分析,并探讨其培养特性,为进一步开发利用桑黄菌提供科学依据。【方法】利用核糖体基因rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列并结合形态学特征,对野生桑黄菌株(编号SA-1)进行鉴定;基于ITS1-5.8S-ITS2序列,对菌株SA-1和桑黄孔菌属的桑树桑黄、高山桑黄、锦带花桑黄、杨树桑黄、环区桑黄、小孔忍冬桑黄、暴马桑黄共8个菌株进行亲缘关系和系统发育分析;设置不同碳源、氮源、无机盐、温度和pH开展单因素试验,分析各培养因子对桑黄菌株菌丝生长的影响,并运用L_9(3~4)正交试验对培养条件进行优化。【结果】根据菌株形态学特征和rDNA ITS序列分析,将野生菌株SA-1鉴定为桑树桑黄(Sanghuangporue sanghuang),但其与桑黄孔菌属中其他6个菌株的遗传距离较远。系统发育进化树结果显示,桑树桑黄和菌株SA-1聚为一类(bootstrap=100%),其他6个菌株聚为另一类。单因素试验确定SA-1菌丝生长的适宜培养温度为27.5℃,最适pH为7.0,最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为蛋白胨,最佳无机盐为KH_2PO_4;经正交试验得到最适培养条件为可溶性淀粉20 g/L,蛋白胨4 g/L,KH_2PO_4 1 g/L,培养温度30℃。【结论】确定浙江地区采集的野生桑黄菌株为桑树桑黄(S.sanghuang),并初步筛选出了该菌株的适宜培养条件。     

基于rDNA序列分析的3种丛枝菌根真菌分子鉴定方法比较

【目的】比较基于rDNA序列分析的3种丛枝菌根（AM）真菌分子鉴定方法,为提高AM真菌在种水平分子鉴定的准确性提供参考。【方法】对从柑橘和甘蔗等广西地区主要作物的根际土壤中分离出的AM真菌菌株（编号为A6、B3和GY3-1）进行形态学鉴定,再通过巢式PCR分别扩增AM真菌的18SrDNA、28Sr DNA及含ITS1、5.8SrDNA和ITS2的序列（简写为ITS1+5.8S+ITS2）,分别将其测序结果与GenBank数据库进行比对,并构建系统发育进化树,再结合形态学鉴定结果比较基于3个r DNA序列分析分子鉴定方法的准确性。【结果】菌株A6、B3和GY3-1的形态特征分别与幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）、黏质隔球囊霉（Septoglomus viscosum）和摩西斗管囊霉（Funneliformismosseae）一致。基于18SrDNA序列,将菌株A6鉴定为近明球囊霉属（Claroideoglomus）,菌株GY3-1鉴定为摩西斗管囊霉（F. moessae）,菌株B3鉴定为黏质隔球囊霉（S. viscosum）。基于28S rDNA序列...     

野生桦褐孔菌的鉴定及ITS序列系统发育分析

依据子实体的形态特征、培养特性,对采自黑龙江省大兴安岭呼中国家级自然保护区的野生药用真菌进行了鉴定。结果表明:该菌PCR扩增产物长761 bp。ITS序列聚类结果表明,该菌种与Inonotus obliquus isolate FS656163以及Inonotus obliquus strain MDJCBS88同源性最近,为桦褐孔菌的不同菌株,而与Inonotus linteus strain PL08121和Inonotus rickii isolate PF241亲缘性最远,都属于纤孔菌属。结合分子生物学与形态学鉴定,一致确定其为桦褐孔菌(Inonotus obliquus)。     

刺盘孢属真菌PCR检测方法的建立

【目的】刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是重要的植物病原菌,引起植物炭疽病。建立刺盘孢属真菌PCR检测方法。【方法】比对分析刺盘孢属及其近似属的ITS序列,设计刺盘孢属特异性引物,建立PCR扩增体系,验证引物的特异性和灵敏度。【结果】设计出刺盘孢属特异性引物ITS-c3/c4,建立了刺盘孢属常规PCR检测体系。建立的PCR体系能从刺盘孢属菌株中扩增出449 bp的特异性条带,刺盘孢属的近似属菌株未能扩增到条带。灵敏度试验可检测到DNA的浓度为2.2 pg/µL。【结论】用建立的PCR体系对炭疽病梨果实样品进行检测,可从发病组织中检测到刺盘孢属真菌。建立的PCR方法可靠、灵敏度高,能够快速、准确检测出刺盘孢属真菌。     

十一个桑黄菌株的形态学观察与分子鉴定

为明确桑黄菌株的种属,对采集自国内不同地区的11个桑黄类似菌株开展分子鉴定和形态学特性观察,主要采用核糖体基因rDNA内转录间隔区(ITS)对桑黄菌株进行基因鉴定和遗传性状分析,运用Mega7.0软件的neighbor-joining(NJ)法构建基于桑黄rDNA ITS序列的系统发育进化树,结合桑黄菌株的形态学观察(菌丝生长情况、菌丝的显微结构、孢子形态特征、子实体电镜扫描结构)进行分析鉴定。结果表明：11个桑黄菌株分为两大类群,其中菌株SH-1为一类,属于纤孔菌属(Inonotus);其他菌株(SH-2、SH-3、SH-4、SH-5、SH-6、SH-7、SH-8、SH-9、SH-10、SH-11)属于另一类,为桑黄孔菌属(Sanghuangporus),菌株SH-3和SH-6属于桑树桑黄(S.sanghuang),其余8个菌株属于暴马桑黄(S.baumii)。通过rDNA ITS序列分析技术结合桑黄菌丝形态特征、孢子形态特征和子实体显微结构特征分析,能明确桑黄的种属与遗传性状,可为今后桑黄品种选育与人工规模化生产提供理论依据。     

槟榔芋软腐病生防真菌的筛选

【目的】以福鼎槟榔芋为研究对象筛选生防菌株,为槟榔芋软腐病生物防治提供可用菌株。【方法】从福鼎槟榔芋根际土壤和健康植株球茎内分离得到22株真菌,经离体球茎试验筛选,共筛选出9株对槟榔芋软腐病具有防治效果的真菌菌株。对这9株菌株进行分子鉴定、常规形态特征观察、生理生化测定和田间活体防效等,进一步筛选可用菌株。【结果】得到2株有较好防治效果的菌株CAF-H001和CAF-L002。扩增菌株的ITS1/ITS4 DNA,经测序后与NCBI数据库进行同源性比对,结果显示菌株CAF-H001与藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)相似度100%,菌株CAF-L002与塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)相似度100%。其中,菌株CAF-H001为白色菌体,细长型分生孢子,最适pH为9,最适温度为28℃,以淀粉作为碳源、蛋白胨作为氮源时生长最佳;菌株CAF-L002为黑褐色菌体,球形分生孢子,最适pH为8,最适温度为32℃,以淀粉作为碳源、酵母浸粉作为氮源时生长最佳。【结论】本研究分离鉴定的菌株CAF-H001和CAF-L002分别为藤仓镰刀菌和塔宾曲霉,具有较好的生防应用价值,为槟榔芋软腐病的生物防治提供了基础。     

1株抗小麦病原真菌活性的射干内生真菌的筛选鉴定及其聚酮合酶基因分析

【目的】挖掘有用的射干内生真菌资源,并为其合理利用提供一定的参考依据。【方法】从射干根中分离获得了1株内生真菌,采用形态学和分子生物学手段鉴定其属种,采用菌丝生长速率法测定其发酵液对禾谷镰刀菌和小麦根腐离蠕孢的抑菌作用,并分析该菌株的聚酮合酶基因序列和生物学特性。【结果】结合形态学和ITS序列同源性分析将菌株鉴定为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。该菌株的发酵液对禾谷镰刀菌和小麦根腐离蠕孢的菌丝生长有较好的抑制作用。SG5菌株的PKS氨基酸序列与Gen Bank所报道的层出镰刀菌的PKS序列相似性为99.7%。菌株最适生长的固体培养基为察氏培养基,最适碳源为蔗糖,最适氮源为硝酸钾,最适pH为7;在NaCl质量分数≤1%的培养基上正常生长。【结论】该拮抗内生真菌是潜在的小麦病原真菌生防菌资源,具有一定的开发与应用价值。     

2种野生羊肚菌分离、鉴定与菌丝培养条件

【目的】获得野生羊肚菌资源,并探讨其菌丝最适培养条件。【方法】采用组织分离获得菌株纯培养;采用形态和内转录间隔区ITS鉴定确定分类地位;综合生长速度和长势,确定菌丝的最适生长条件。【结果】从北京和山西分离羊肚菌纯培养YBJ和YSX菌株,分别为羊肚菌(Morchella esculenta)和小羊肚菌(Morchella deliciosa)。YBJ菌株最适碳源为可溶性淀粉和山梨醇,最适氮源为胰蛋白胨,最适C/N比范围为10/1~30/1;最适温度为24℃;最适pH为8.0。YSX菌株最适碳源为麦芽糖;最适氮源为胰蛋白胨;最适C/N比为60/1;最适温度为24℃;最适pH为8.0。【结论】获得2株野生羊肚菌菌株,并确定其分类名称和培养条件。     

几条热点 DNA 条形码序列对海南大戟科植物鉴定能力比较

【目的】比较 ITS2、ITS、psbA-trnH、rbcL、matK 序列对海南大戟科植物的鉴定能力。【方法】利 用 PCR 测序法对供试样本目的片段进行双向测序,所得序列经 Codon Code Aligner 拼接后,利用 MEGA 6.0 进行 相关数据分析,利用 TAXON DNA 软件分析序列种内、种间变异并作 barcoding gap 分析。【结果】5 条候选序列 的序列获得率分别为 86.96%、76.81%、89.86%、79.71%、49.28%;ITS2 序列的变异系数和信息位点系数最大; ITS2 序列存在明显的 barcoding gap,种间与种内变异分布呈两边分开的趋势。ITS 序列虽存在 barcoding gap,但种 内变异和种间变异有较多的重叠区;psbA-trnH 和 matK 序列 barcoding gap 均不明显,同时种内变异和种间变异有 较多的重叠区;rbcL 序列虽 barcoding gap 不明显,但种内变异和种间变异重叠比例较小。【结论】ITS2 条形码序 列对海南大戟科植物鉴定能力强,rbcL 序列不能作为单独的条形码鉴定物种,但可以作为 ITS2 的补充条形码。     

土生空团菌(Cenococcum geophilum Fr.)的菌种鉴定及其遗传多样性的初步分析

 【目的】鉴定外生菌根真菌土生空团菌（Cenococcum geophilum Fr.（Cg））菌种，分析土生空团菌的遗传多样性，探讨影响土生空团菌遗传分化的因素。【方法】采用形态特征结合PCR方法，从分离自6种寄主植物的27个中国菌株和来自法国的5个Cg菌株中鉴定出20个Cg菌株。利用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和随机扩增片断多态性DNA（RAPD）两种分子标记方法对这20个Cg菌株进行遗传多样性分析。【结果】PCR-RFLP方法以通用引物ITS1和ITS4对20个Cg菌株的核糖体DNA转录间隔区（ITS）进行了PCR扩增，扩增产物用3种内切酶（EcoRⅠ、HinfⅠ和MboⅠ）酶切，酶切图谱显示菌株间有明显差异。RAPD方法用经过筛选的随机引物（5'-CGCACCGCAC-3'）对20个菌株的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物的片段大小在300～2 000 bp范围之间，共产生19个多态性位点。根据电泳图谱上DNA带的数目、位置及强度进行数值化，用聚类分析软件计算菌株间的遗传距离和遗传相似性，根据遗传距离构建20个菌株的系统聚类图。【结论】来源于不同寄主及地域的20株Cg有着较丰富的遗传多样性；地理环境和寄主对Cg遗传多样性的影响不大。     

不同荆芥种质资源的AFLP标记和ITS序列分析

【目的】利用AFLP标记和ITS序列分析方法,对11份荆芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)种质进行分析鉴定,为荆芥种质资源鉴定和利用提供理论依据。【方法】以11份荆芥幼苗为材料,提取基因组DNA,利用6种引物组合对其进行AFLP标记分析。利用ITS引物对荆芥样品进行PCR扩增、测序,利用DNAMAN软件分析11份种质的ITS序列,对其进行鉴定。【结果】荆芥AFLP标记多态性不高,选用的6个引物组合扩增出条带241条,多态性条带154条,多态性比率为63.90%;对供试材料AFLP数据结果进行聚类,亲缘关系较近或引种频繁地区荆芥种质资源聚类在一起。ITS序列分析结果表明,供试的11份荆芥材料的ITS序列完全相同,表明荆芥种质间ITS序列保守性较强。【结论】同时利用AFLP标记和ITS序列分析对荆芥种质资源进行鉴定,可以有效提高检测的准确性。     

药用真菌桑黄分子鉴定及遗传多样性分析

通过对不同来源的桑黄菌株进行分子鉴定和遗传多样性分析,为后续桑黄种质资源的研究、开发及利用提供参考。采用rDNA ITS序列分析技术,对收集到的国内22个桑黄菌株进行分子鉴定与遗传多样性分析。依据rDNA ITS序列计算遗传距离并构建系统发育树,结果显示收集到的桑黄菌株明确聚为3个独立类群,且3个类群的桑黄真菌存在明显的遗传分化。通过BLAST分析,成功鉴定出3类桑黄种质分别为:桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)、杨树桑黄(Fuscoporia gilva)及丁香桑黄(Inonotus baumii)。不同来源的桑黄菌株间具有一定的遗传多样性,种间遗传趋异度显著高于种内。本研究结果提供了一种准确可靠且简单易行的桑黄真菌分子鉴定技术,可明确各桑黄真菌的种属来源及遗传结构组成,为桑黄真菌的进一步研究及开发应用奠定了基础。     

中国兰中几种常见DNA条形码标准序列的PCR扩增方法

[目的]DNA条形码技术是分子鉴定的最新进展之一,为了研究中国兰的DNA条形码技术,实现中国兰的快速鉴定。[方法]该文通过电泳成像技术、BLASTN核苷酸相似序列检验等分析方法,对一种中国兰ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等常用DNA条形码标准序列PCR扩增的方法进行了可行性检验。[结果]该方法可以在中国兰中有效扩增ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等条形码序列,并通过双向测序获得序列信息,ITS标准序列由于引物存在非特异性扩增,需要重新设计合适的引物。[结论]利用该方法,可以有效获得中国兰中ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等几种常见DNA条形标准序列,并大大简化了PCR反应操作步骤,为进一步研究中国兰的DNA条形码技术提供了参考和借鉴。     

1株野生红侧耳菌株分离鉴定及人工驯化栽培

【目的】对1株野生侧耳菌株PD2021进行分离鉴定及人工驯化栽培,为该菌株的大规模栽培及开发利用提供理论依据。【方法】以从云南省西双版纳州景洪市采集到的1株野生侧耳菌株PD2021为试材,采用组织分离法获得其母种,结合子实体形态学观察、侧耳属DNA条形码和分子系统发育分析界定其分类地位,并通过培养特性试验探究其生物学特性及出菇条件,采用正交试验筛选人工室内栽培该菌的栽培配方。【结果】通过形态学观察发现,PD2021菌株实体为呈淡米黄色,孢子印为白色,菌盖成熟时边缘呈波浪形花瓣状,菌盖边缘与中部交界处有一圈环状、参差不齐的条纹、整个子实体似一朵花子。结合侧耳属DNA条形码分析结果,将PD2021菌株鉴定为红侧耳花形变种（Pleurotusdjamor var. floreus）。PD2021菌株的ITS序列和延伸因子基因（EF-1α）序列均与P. djamor相似性最高,处于系统发育进化树中的同一分支,但二者分支长短不一,表明二者序列出现变异,进一步证明PD2021菌株为红侧耳的变种。该菌株最适生长的碳源为可溶性淀粉,最适生长的氮源为酵母粉,最适温度为26℃;菌丝耐高温能力强,44℃下处...     

2株耐热真菌的分离鉴定及其产酶活性研究

【目的】对新疆玛纳斯火烧洼热气泉土壤样品中,分离出的2株耐热真菌MHS7和MHS9进行鉴定,并研究其产酶活性。【方法】利用平板稀释涂布法分离筛选耐热真菌,基于菌株形态学特征和r DNA ITS序列分析,对分离得到的耐热真菌菌株进行初步分类鉴定;分别测定各菌株产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶和糖苷酶的能力。【结果】得到2株耐热真菌MHS7和MHS9,初步鉴定菌株MHS7属于小裸囊菌属(Gymnascella),菌株MHS9属于曲霉属(Aspergillus)。产酶活性检测表明,菌株MHS7和MHS9均能产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶,其中,菌株MHS9产淀粉酶和蛋白酶的活性相对较高。【结论】耐热真菌MHS7和MHS9均能同时产四种酶,具有潜在的应用价值。     

基于ITS2条形码序列鉴定中药材续断及其混伪品

【目的】利用ITS2序列对中药材续断及其混伪品进行DNA条形码鉴定,从而确保用药安全。【方法】对续断及其混伪品ITS2进行扩增并双向测序,经CodonCode Aligner V3.7.1拼接比对后,用MEGA 5.0计算种内种间K2P遗传距离,并构建NJ系统聚类树进行鉴定分析。【结果】续断药材ITS2序列比对后长度为218bp;种内K2P遗传距离分布于0~0.009 4,种间K2P遗传距离分布于0.033~0.188 2,NJ树显示续断药材及混伪品可明显区分,表现较好的单系性。【结论】ITS2序列作为DNA条形码能准确鉴别续断药材。     

一株小脆柄菇的分离培养及木质素降解酶活性

【目的】为一株野生小脆柄菇开发利用奠定理论和实验基础。【方法】采用组织分离法获得菌株纯培养,提取菌丝体总DNA提取、ITS扩增与测序、BLAST在线比对,利用MEGA 7.0软件进行构建发育树,并计算遗传距离。综合菌丝生长速率和长势,确定其最适生长条件。采用光吸收法测定漆酶、锰过氧化物酶和木素过氧化物酶酶活。【结果】获得纯培养菌株,编号F1734,经鉴定为白黄小脆柄菇(Psathyrella candolleana)。菌丝最适生长条件结果表明:最适碳源为麦芽糖,最适氮源为胰蛋白胨,最适C/N比为10/1,最适温度范围为25～30℃,最适pH值范围为7.0～9.0。液体发酵产木质素降解酶结果表明,锰过氧化物酶在第7天时达到最大,为(186.32±7.29)U/mL;木素过氧化物酶在第5天时达到最大,为(4 890.20±979.37)U/mL;发酵9d未测得胞外漆酶活性。【结论】F1734菌株为白黄小脆柄菇,营养需求简单,属于LiP-MnP类白腐真菌,为其进一步开发利用奠定试验基础。     

采自甘南州的21株野生羊肚菌的分子学鉴定

甘南藏族自治州境内高寒阴湿温差大,土壤肥力高,适宜羊肚菌生长。经对采自甘南藏族自治州的野生羊肚菌进行组织分离,获得21份菌丝培养物,并对其采用ITS、ef1-α、rpb1以及rpb2片段联合矩阵序列分析鉴定。结果表明,21个供试菌株均属黑色羊肚菌支系,其中19株为三地羊肚菌(Morchella eohespera),2株为羊肚菌属Mel-13,且这2种羊肚菌目前已实现人工栽培。