2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RT-PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49copies/μL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性。该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RTPCR方法检测结果无显著性(P0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用.【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测.【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×103、4×103copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性.该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(Pgt;0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于PCV1.【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势.     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×10~3、4×10~3 copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性。该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(P0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于PCV1。【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用.【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测.【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×103、4×103copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性.该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(Pgt;0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于PCV1.【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势.     

猪圆环病毒2型与3型双重PCR检测方法的建立

【目的】建立针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的一种双重PCR检测方法。【方法】先优化猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的单独PCR检测方法条件,在此基础上优化这2种猪圆环病毒的双重PCR检测方法条件,之后进行其特异性与灵敏度的检测,并进行初步临床应用检测。【结果】建立的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型双重PCR检测方法对猪圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病病毒等当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性,检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的灵敏度分别是610、800 copies/μL。该方法对120份仔猪样品的检测结果显示,猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检出率分别为56.7%和38.3%,虽然稍低于各自单独PCR检出率;但并没有显著差异(P0.05),且与单独PCR检测方法的符合率都达到95%以上。【结论】建立了一种特异性强、敏感性高的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法,为区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型提供了一种快速检测方法。     

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249）,母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%）,最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

新现猪圆环病毒3型及圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的新现猪圆环病毒3型(PCV-3)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的OFR2基因设计了2对扩增PCV-3和PCV-2的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV-3和PCV-2的双重PCR方法。敏感性和特异性结果显示,该方法对PCV-3和PCV-2的最低核酸检测量均为1.0×103拷贝/μL,而对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)的扩增结果均为阴性。应用所建立的双重PCR检测了临床上256份样品,结果表明,PCV-3和PCV-2感染的阳性率分别为0.78%(2/256)和86.3%(221/256),仅有1份样品为PCV-3和PCV-2混合感染,混合感染阳性率为0.39%(2/256)。试验结果表明,本研究建立的PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中PCV-3和PCV-2的临床快速诊断和流行病学调查提供了一种工具。     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,并对其进行特异性、灵敏性、可重复性检验.特异...     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

兰花两种主要病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)这两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物,在CymMV和ORSV单一RT-PCR优化体系的基础上,建立了同时检测CymMV和ORSV的双重RT-PCR检测方法。此方法可特异性地从感染CymMV和ORSV的样品中扩增出2条目的带,即CymMV(781 bp)和ORSV(588 bp)。扩增产物测序表明,CymMV扩增产物与GenBank中登陆的分离物核苷酸同源性为84%~97%,ORSV扩增产物与GenBank中其它分离物的核苷酸序列同源性为98%~99%。运用该方法对随机抽取的田间样品及组培苗样品进行检测,都得到了特异性扩增条带,其灵敏度达到了10-5。     

猪非典型性瘟病毒与猪流行性腹泻病毒双重PCR方法的建立与应用

为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒(APPV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据Gen Bank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列,分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列,设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化,分别扩增出190 bp和500 bp的特异性片段。建立的双重RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(RV)的检测均为阴性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为1μl 2.65×10~5和1μl 3.56×10~4,对四川遂宁、眉山等地采集到的腹泻、肌肉震颤的病料进行检测,PEDV、APPV阳性病料检出率分别为41. 18%和11. 76%,经分别与特异性检测APPV和PEDV的单一RT-PCR法检测结果进行比较分析,符合率均为100%。与单一RT-PCR检测方法具有相同特异性和重复性,可用于临床检测。     

马鼻肺炎双重荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用

【目的】建立快速、准确检测马疱疹病毒 1 型（EHV1）和 4 型（EHV4）的双重荧光定量 PCR 检 测方法。【方法】以 EHV1、EHV4 的全基因组序列为基础,针对糖蛋白 B（gB）基因的保守序列,分别设计 EHV1 与 EHV4 特异性引物和探针,筛选引物,优化反应条件,分型检测马疱疹病毒（EHV1、EHV4）。【结果】 检测到 EHV1、EHV4、EIV、EAV、EVJ 和 EIAV 标准毒株,EHV1、EHV4 为阳性结果,其余病毒为阴性结果; EHV1、EHV4 DNA 模板的最低检出限为 1.47×102 copies/μL;检测 64 份临床样本,阳性检出率为 14.06%,病 毒分离证实 100% 符合。【结论】双重荧光定量 PCR 检测方法可直接应用于检测并区分 EHV1、EHV4, 并可在 短时间内获得对 EHV1/EHV4 特异性及敏感性的检测结果。     

猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用

根据国外已发表的猪环状病毒2型（PCV－2）的全基因组序列，设计一对2型特异性引物，对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD18－T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中，经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定，证明扩增出了PCV－2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV－2序列进行比较，发现同源性均在90％以上。用该PCR方法在43份可疑病料中检测到了12分PCV－2阳性病料，表明该病在我国已有流行。     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。     

检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立

[目的]为快速诊断猪圆环病毒病提供参考。[方法]根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,建立诊断PCV-2地方分离株的PCR方法。[结果]各物质在PCR反应中最佳浓度分别为:dNTP 220 pmol/ml,Taq酶0.1 U/μl,引物20 pmol/μl。从PCV-2阳性病料中提取DNA,在优化条件下进行PCR扩增,获得预期的494 bp特异性条带。用该PCR方法对PCV-2、PRRSV、HCVS、IV、PPV进行检测,PCV-2为阳性,而PRRSV、HCV、SIV、PPV检测均为阴性,未出现交叉反应,说明该PCR方法对PCV-2具有良好的特异性。该PCR方法可检出1.25 ng模板DNA,具备较高的敏感性。[结论]使用该PCR方法检测PCV-2是切实可行的。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重PCR方法。本研究根据GenBank中登录的PEDV和PCV3基因组序列,分别在M基因和Rep基因高度同源保守区设计2对特异性引物,建立了检测PEDV和PCV3双重PCR方法,即可同时扩增225bp(PEDV)和138bp(PCV3)2条特异性片段,而该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌核酸扩增均为阴性;PEDV和PCV3的最低检出量分别为428和325拷贝/μL,且特异性强、敏感性好,为快速、高效检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。