超声波处理对根癌农杆菌介导转化金钗石斛影响的初步研究

以金钗石斛的类原球茎体（PLB6）为受体材料,研究了侵染前材料不同创伤处理对农杆菌介导转化频率的影响。结果表明：25KHz超声波40～80W处理5～10min或100W处理5min对PLBs死亡率无不良影响;1／2MS液体培养基适宜作为超声溶液;80～100W超声波处理5min的PLBs在转化后GUS染色每100mg鲜重材料上的蓝色斑点数由常规方法处理的0～0．54提高到6．05～7．90,GUS基因瞬时表达频率得到提高;筛选两个月后多数PLBs的GUS基因仍能稳定表达。说明超声波处理能提高农杆菌介导转化金钗石斛PLBs的频率。     

利用正交设计优化金钗石斛的转化体系

为优化金钗石斛的转化体系,以其类原球茎(PLBs)为材料,利用正交设计研究了影响农杆菌介导转化的因素.结果表明:PLBs预培养1 d、侵染的菌液OD600值1.2、乙酰丁香酮(AS)100μmol/L、共培养5 d时,每100mg鲜物质量材料上的GUS染色蓝点数最多;单因子试验表明AS适宜的浓度为50μmol/L;PCR结果显示得到了转化呈阳性的PLBs;初步表明此体系可用于金钗石斛的遗传转化研究.

Abstract：

In order to optimize the Agrobacterium-mediated transformation system for Dendrobium nobile Lindl, effects of preculture time, bacterial concentration, acetosyringon (AS) concentration and co-cultivation time on Agrobacterium-mediated transformation of protocorm like bodies (PLBs) of D. nobile Lindl were studied in an experiment with orthogonal design. The results showed that number of GUS staining blue spots per 100 mg flesh weight of PLBs was the greatest in the treatment of the combination of preculture for one day, 1.2 of bacterial concentration (OD600), 100 μmol/L of concentration of AS and co-culture for five days. Single factor experiment showed that the appropriate concentration of AS was 50 μmol/LPCR confirmed that positive transformed PLBs were obtained. It is tentatively concluded that this system can be used in the study of transformation of D. nobile Lindl.     

农杆菌注射法转化草莓果实细胞的研究

利用农杆菌注射法对草莓果实细胞进行了转化研究.以草莓(Fragarua×ananassa)品种丰香和红脸颊为试材,研究了农杆菌菌株的种类及其浓度、不同注射部位、果实发育时期和草莓基因型对转化效率的影响.结果表明:选用菌液OD600值为2.4的EHA105菌株,取花后19d大小的果实,从果蒂部位进行注射时转化效果最好,GUS染色率可达95%.本研究初步建立了能使外源基因在草莓果实细胞中高效表达的注射法转化体系,是草莓果实发育特性相关基因功能鉴定的可行方法.     

农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用

为了研究农杆菌和质粒DNA两种子房注射法对普通棉花品种的转化效率,以8891棉花为材料,分别在三亚和常德两地进行了转化试验。结果表明：与质粒DNA注射相比,三亚地区农杆菌注射的转化效率高1.25个百分点;但农杆菌子房注射的落铃率高,获得的种子相对较少;而在不同的地点试验,常德地区的落铃率显著高于三亚地区;而质粒DNA直接注射的成铃率更高,虽然转化率相对较低,但也能获得有效的转化植株。     

农杆菌介导多年生黑麦草转化体系的建立

以胚性愈伤组织系,作为转化受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,将报告基因gus和抗除草剂基因bar     

花粉管通道及子房注射法转化Anti-TrxS基因

以 1 3个小麦品种 (品系 )的植株体为受体材料 ,用花粉管通道及子房注射法进行了硫氧还蛋白反义基因 (Anti TrxS)的遗传转化。花粉管通道法共处理小花 2 0 36朵 ,收获T0 种子1 61 6粒 ,结实率为 79.4% ,将T0 种子大田点播成株行 ,T1 共出苗 1 42 4棵 ,出苗率为 88.1 %。对T1 苗按品种和处理组合的方式进行抽样检测 ,抽样株系取 1 0个单株分别提取叶片基因组DNA ,然后将单株叶片DNA等量混合 ,进行株系基因组DNA的PCR检测。检测结果为 30个株系中有 1 6个株系呈阳性反应。子房注射法共转化豫麦 49号、豫麦 70号、豫麦 1 8号、郑新 991、95 5 1 9五个小麦品种 (品系 )的小花 1 2 0 6朵 ,收获种子 89粒 ,结实率为 7.4% ,T1 共出苗 41棵 ,出苗率为 46.1 %。     

农杆菌介导的玉米自交系Z21遗传转化体系的研究

农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化效率一直是影响玉米转基因研究的重要因素。针对玉米自交系Z21,在外植体大小、农杆菌浓度和共培养时间等多个方面进行了探究。结果表明,在幼胚大小1.5~2.0 mm、农杆菌浓度OD_(600)为0.9~1.2、共培养3 d的条件下,Z21的外源基因表达效率最高。通过优化影响农杆菌介导转化的各种因素,初步建立了玉米自交系Z21的高效遗传转化体系。     

农杆菌介导的小麦活体转化

 将含有NptII基因表达载体的农杆菌滴入小麦小花中进行小麦活体转化 ,通过对幼胚和成熟种子进行卡那霉素抗性初步筛选 ,并通过PCR和Southern杂交进行分子水平鉴定。结果显示 ,在所试的 5个品种 (系 )中 ,获得转化植株效率为 2 .0 %～ 3 .2 % ,由此初步建立农杆菌介导的简便有效的小麦活体转化方法     

农杆菌介导北方粳稻转化体系的研究

通过农杆菌介导的方法将Bar-Bt基因（抗除草剂基因和抗虫基因构建在同一载体上的双基因）整合到北方优质粳稻龙稻6号、松粳9号等品种中;分别以供试品种的幼胚和成熟胚为外植体诱导愈伤组织,携带有Bar-Bt基因双元载体PCAMBIA1301号的根癌农杆菌EHA105为载体,GUS基因的瞬时表达率为衡量指标,对影响农杆菌介导的龙稻6号、松粳9号等品种的转化效率的主要因素进行了研究。结果表明：农杆菌侵染愈伤组织的菌液浓度以D（600nm）=0.8～1.0较为适宜,最佳共培养时间为2～3 d,预培养时间为5 d,共培养培养基中添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的转化效率有明显提高。     

根癌农杆菌介导的甜瓜遗传转化

以甜瓜子叶为根癌农杆菌介导转化的受体,通过GUS基因瞬间表达率的分析,研究影响转化体系的重要试验参数.试验结果表明,甜瓜对卡那霉素耐性高,筛选浓度可高达150 mg/L,Ag+能促进转化率,而AS不能促进转化率.前期的消毒效果与季节有很大的关系,不同季节选择不同的消毒方式更能节约种质资源.     

根癌农杆菌介导 hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究

以摩尔多瓦葡萄早期体细胞胚为受体,通过农杆菌介导辅以超声波处理转化 hGLP1基因。结果表明,摩尔多瓦葡萄体细胞胚的卡那霉素临界致死质量浓度为10 mg/L,农杆菌浸染时辅以超声波处理可显著提高GUS瞬时表达效率（高达69.4%）。采用此体系对摩尔多瓦葡萄进行转化,获得高瞬时表达和稳定表达的转化子,进一步筛选培养获得7株抗性再生植株。利用PCR扩增的方法进行检测,其中2株PCR检测呈阳性,初步证实 hGLP1基因已整合到摩尔多瓦葡萄基因组。     

金钗石斛低聚糖纯品对乳杆菌抗应激能力的影响

利用水作为溶剂从金钗石斛中提取糖类成分,经无水乙醇沉淀脱蛋白质和多糖,再经大孔树脂分离,得到的低聚糖通过葡聚糖凝胶柱,获得1个低聚糖纯品。将纯品冷冻干燥后,添加到乳杆菌的培养基中,分别对乳杆菌的生长曲线、耐热性、抗苯酚抑制作用进行了实验研究,结果表明,金钗石斛低聚糖在促进乳杆菌生长、降低高温对于乳杆菌的伤害和苯酚对于乳杆菌的伤害方面都有明显效果。     

根癌农杆菌介导的花青素调节基因 LC NtAn2 转化烟草的研究

旨在研究花青素调节基因LC-NtAn2对烟草花青素合成的影响,以普通烟草品种"97204"叶片为受体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,C58C1)介导法,进行LC-NtAn2基因转化普通烟草的研究。经共感染和潮霉素抗性筛选,获得29株抗性再生植株。经PCR特异性检测和RT-PCR检测,初步证明LC-NtAn2基因已被整合到烟草基因组,并可以正常转录。观察发现,导入LC-NtAn2基因的烟草植株的叶片颜色并无明显改变;检测发现,转基因植株与非转基因植株叶片中花青素无显著差异。     

梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-1和HaFT-2克隆及表达分析

根据前期梭梭干旱转录组测序得到的Unigene序列,成功克隆2个梭梭14-3-3蛋白基因,分别命名为HaFT-1和HaFT-2,并对其进行基因表达分析。结果表明:HaFT-1基因在梭梭的根、种子中均可表达,且根中表达最强;HaFT-2基因在梭梭同化枝中表达最强,根的表达量次之。干旱胁迫后HaFT-1和HaFT-2基因的表达量均下调。本研究初步分析HaFT-1、HaFT-2基因的表达模式,为进一步研究该基因功能奠定基础。     

农杆菌介导TLPD34基因的玉米遗传转化及检测

以玉米优良自交系郑58为受体材料,将抗真菌病害的水稻类甜蛋白基因(TLPD34)转入玉米,获得451株转化植株,经200mg/L草胺磷有效质量浓度筛选,得到57株抗性苗,T0代检测后,最终获得13株阳性植株,转化率达2.9%。对T0代PCR检测呈阳性的植株进行RT-PCR发现,部分植株能够进行正常转录。表明该方法能将外源基因TLPD34整合到玉米自交系郑58基因组中并进行正常转录。     

玉米中过表达 ZmMRP-1基因的遗传转化与产量鉴定

构建植物过表达载体pHZM1N-P ZmMRP-1::ZmMRP-1，利用农杆菌介导的玉米愈伤组织转化法将其导入玉米自交系A188中，获得12个独立的PCR阳性转化株系。对转基因株系进行Southern blot检测、qRT-PCR分析，发现OE-8、OE-19株系以单拷贝形式插入玉米基因组中并过量表达。对获得的转 ZmMRP-1基因T2代材料进行玉米产量相关性状考察，相比较野生型，转基因株系在粒长、粒宽、百粒质量等方面均显著提高，可有效改良玉米产量相关性状，为高产转基因玉米新品种培育提供基础材料支持。     

宁夏小麦Glu-A3与Glu-B3位点等位变异组成分析

低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)与小麦品质密切相关。为给宁夏小麦的品质改良提供参考,应用STS分子标记,对宁夏98份小麦品种Glu-A3和Glu-B3位点的等位基因变异类型组成进行检测和分析。结果表明,宁夏98份小麦品种Glu-A3位点存在Glu-A3a(4.0%)、Glu-A3b(2.0%)、Glu-A3c(55.1%)、GluA3d(10.1%)和Glu-A3e(28.5%)5种等位变异;Glu-B3位点存在Glu-B3a(2.0%)、Glu-B3b(8.1%)、Glu-B3c(5.0%)、Glu-B3d(7.1%)、Glu-B3f(21.4%)、Glu-B3g(2.0%)、Glu-B3h(15.3%)和Glu-B3i(13.3%)8种等位变异。宁夏参试品种共存在23种等位变异组合形式,其中引黄灌区存在18种组合类型,Glu-A3c/Glu-B3j(17.7%)和Glu-A3e/Glu-B3f(16.2%)组合类型较为普遍;宁南山区存在13种组合类型,以Glu-A3c/Glu-B3i(20.0%)组合类型为主。在参试的宁夏小麦品种中,对同一地区不同来源品种而言,改良品种的LMW-GS遗传多样性明显较引进品种和地方品种更丰富。     

过敏反应促进蛋白基因hrap转马铃薯的研究

利用根癌农杆菌介导法,将由甜椒中分离出的一种过敏反应促进蛋白hrap基因导入马铃薯品种"Russet Burbank"和"大西洋"中。转化再生植株经过含卡那霉素培养基的生根筛选、PCR检测、Southern杂交鉴定表明目的基因已导入马铃薯品种中,RT-PCR检测结果表明目的基因已整合到马铃薯DNA中并表达。通过对转基因植株进行活体接种抗病性检测,获得了抗晚疫病和抗青枯病的植株。     

Streptomyces yanglingensis KM-1-2遗传转化体系的建立及 km790的过表达

杨凌链霉菌（Streptomyces yanglingensis）KM-1-2是从银杏种子中分离到的一株新菌,为对其次级代谢产物基因簇进行研究,需建立该菌株的遗传转化体系。通过接合转移的方法成功建立杨凌链霉菌KM-1-2的遗传转化体系,并确定最佳接合转移条件：以2CMY为接合转移培养基,孢子于50 ℃热激10 min,抗生素覆盖时间介于18~19 h,其中萘啶酮酸质量浓度为25 mg/L,安普霉素为3 mg/L,接合转移效率达 1.052×10^-5。同时,利用该转化体系,过表达KM-1-2基因组中的1个SARP转录调控因子km790。与野生型链霉菌KM-1-2相比,过表达菌株Skm790生长速率加快,产孢时间提前,对部分病原真菌的拮抗性增强,而且代谢产物图谱发生明显变化。     

TmFAD2和BnFAD3双基因载体的构建及转化株脂肪酸分析

必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。