青杄MYB转录因子基因PwMYB20的克隆及表达分析

【目的】MYB转录因子家族是植物中最大的一类转录因子,在植物生长发育及抗逆调控网络中发挥重要作用。对青杄中MYB同源基因Pw MYB20的克隆与分析,有利于进一步探究Pw MYB20在植物生长发育及逆境响应中的功能,挖掘与利用青杄中的优质基因。【方法】采用RACE-PCR技术,从青杄c DNA文库中克隆得到Pw MYB20基因,并通过PCR技术克隆验证。利用Prot Param、Prot Scale、Fold Index等生物信息学软件对Pw MYB20理化性质进行分析预测。通过BLAST在线工具得到植物同源蛋白,并对其进行比对分析和进化树分析。采用实时荧光定量PCR技术分析Pw MYB20基因在不同组织中的表达性,以及干旱、低温、盐、ABA等非生物逆境胁迫处理后的表达变化。通过亚细胞定位及转录激活活性验证试验,揭示其生物学特性。【结果】通过RACE-PCR克隆得到Pw MYB20 c DNA全长966 bp,含675 bp的完整开放阅读框,编码225个氨基酸。Prot Param工具计算蛋白分子式为C1104H1740N340O330S8,分子质量为25.3 k Da,等电点为9.11;Protscale工具疏水性分析发现,Pw MYB20的疏水位点与亲水位点均匀分布,推测该蛋白为亲水蛋白;Signal P工具预测发现该蛋白没有信号肽结构域;利用Fold Index工具对蛋白质固有无序化进行分析,结果表明该蛋白固有无序化序列较多,推测在生理环境下蛋白的动态活性较大;TMHMM工具预测发现该蛋白没有跨膜结构域。通过对比分析发现Pw MYB20属于MYB家族基因,编码1个R2R3-MYB蛋白。进化树分析结果显示,青杄Pw MYB20与白云杉Pg MYB20聚为一簇。实时荧光定量PCR结果表明,Pw MYB20在种子中的表达量最高,其次是在针叶中,在花粉中的表达相对较少。Pw MYB20对干旱、4℃和ABA处理均有响应,而对Na Cl处理响应相对较弱。在干旱处理下,Pw MYB20表达量先上升后下降;4℃低温处理3 h和12 h时Pw MYB20的表达量上升,在4℃处理6 h时存在波动,呈现上升—下降—上升的趋势;Pw MYB20的表达受ABA处理持续诱导。亚细胞定位分析表明,Pw MYB20是一个主要定位于细胞核中的蛋白质。转录激活活性分析结果显示,Pw MYB20的C端存在转录激活活性,而Pw MYB20全长及其N端没有转录激活活性。【结论】青杄Pw MYB20,作为一个转录因子发挥作用,其转录激活活性位于C端;受干旱、低温和ABA诱导,普遍参与了植物应对逆境胁迫的响应过程。     

青杄转录因子基因PwNF-YB8的克隆与功能分析

【目的】NUCLEAR FACTOR Y(NF-Y)转录因子在真核生物中广泛存在,通常由NF-YA、NF-YB和NFYC 3个亚基形成异源三聚体,来结合下游靶基因启动子中的CCAAT顺式作用元件,进而调控植物的生长发育进程,并参与植物非生物逆境胁迫过程。本研究对青杄中PwNF-YB8基因的表达特性及功能进行分析,揭示其参与的生理过程及对非生物逆境胁迫的响应。【方法】根据实验室前期EST测序及RNA-seq转录组数据分析结果获得青杄NF-Ys家族基因序列,克隆得到PwNF-YB8的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用qRT-PCR分析PwNF-YB8在不同组织和花粉萌发过程中的表达特性,以及高温、盐胁迫、甘露醇、ABA处理后的表达变化。亚细胞定位揭示PwNF-YB8在细胞中发挥功能的场所。通过酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验分别检测PwNF-YB8的转录激活活性以及与PwHAP5的互作情况。农杆菌介导花序侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwNF-YB8过表达株系。利用CRISPR/Cas 9技术获得其同源基因AtNF-YB8的突变体。甘露醇和盐处理后测定野生型(WT)、空载体(VC)、突变体株系(nfyb8-cas9#1/12)和过表达株系(L4、L5)的萌发率、幼苗根长,分析比较不同株系对于渗透胁迫和盐胁迫的耐受能力。【结果】PwNF-YB8基因的开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,具有典型的NF-YB保守结构域,并且与白云杉同源基因具有较近的亲缘关系。SqRT-PCR和qRT-PCR结果表明在青杄的根、茎、针叶和花粉中均能检测到PwNF-YB8的表达,其在花粉中的表达量最高。亚细胞定位试验结果显示,PwNF-YB8定位于细胞核、细胞质中。酵母自激活试验显示PwNF-YB8自身无转录激活活性。进一步对青杄幼苗进行高温(42℃)、盐胁迫、甘露醇和脱落酸处理后发现,PwNF-YB8对干旱和盐2种非生物逆境处理明显响应。PwNF-YB8参与了花粉萌发过程,在花粉萌发36 h时表达量最高。酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明PwNF-YB8能够与NF-YC亚基中的PwHAP5互作,可能共同参与花粉管发育调控。甘露醇或盐处理下,异源过表达PwNF-YB8基因的拟南芥种子萌发率与野生型差异不显著,但其根长表现出一定的生长优势。【结论】青杄PwNF-YB8能够与PwHAP5互作,参与花粉萌发和花粉管生长过程,并在干旱、盐胁迫响应中发挥作用。     

油茶钙调素基因的cDNA克隆与表达分析

在构建油茶近成熟种子cDNA文库的基础上,分离鉴定了油茶钙调素基因CoCaM1、CoCaM2的cDNA序列(Gen Bank登录号:EU856536和FJ649316),它们的长度分别为953 bp和1024 bp,均含有447 bp的开放读码框,编码的149个氨基酸完全相同;它们编码区的核苷酸序列高度一致,仅有25个碱基替代,证实了"多个基因编码一种蛋白"的假设。该蛋白含有19种氨基酸,属于酸性亲水性蛋白,理论等电点4.10,相对分子量16.83 kDa;它含有EF-手臂、半胱氨酸等结构域。该蛋白的亲水性/疏水性、柔性、抗原性具有较好的一致性,并表现高度的柔性。Blast及遗传进化分析表明:该蛋白的氨基酸序列与其它植物钙调蛋白的氨酸序列同源性较高。油茶CoCaM1在花芽到子房形成中的表达量较高;而CoCaM2在果实形成、膨大、油脂积累过程中的表达量较多,而在叶片和成熟种子中较少。这表明它们在花芽发育、果实形成、种子油脂合成积累中发挥着不同的调控作用。     

山西关帝山区青杄育苗与移植技术

青杄耐寒耐寒、适应性强,是北方地区常见的荒山造林树种。同时,青杄树形端正,枝繁叶茂,具有观赏价值,又是园林绿化的良好树种。介绍了山西关帝山林区青杄育苗与移植技术。     

青杄云杉不同植株种子发芽性状的观测与分析

以青杄云杉为材料,观测种子发芽性状,结果表明:不同植株种子发芽率变动在86%~94%之间,均值为90%;发芽势变动在57%~73%之间,均值为65%,发芽率的差异由株间遗传性不同所致。种子具有发芽启动快、整齐的特点,发芽观测时间以14 d为宜。     

油桐LEC1基因的cDNA克隆与序列分析

为了解LEC1(Leafy Cotyledon 1)基因对油桐油脂合成过程的调控机理,以油桐种仁转录组数据库中基因的部分c DNA序列为基础,采用RT-PCR技术从油桐种子中克隆LEC1基因的全长c DNA,并对其进行序列分析。油桐LEC1基因全长c DNA为1 152 bp,编码区为729 bp(142~870),编码243个氨基酸,5′端非编码区和3′端非编码区分别为141 bp和263 bp。该基因编码蛋白质的相对分子质量为27 025.4 Da,理论等电点为6.97;蛋白二级结构以不规则卷曲和α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。经对比发现,油桐LEC1具有典型的HAP3结构特点,在不保守的N端和C端中间有1个十分保守的结构域,与拟南芥、玉米、麻风树、黄连木等的LEC1氨基酸序列高度同源。     

硕桦青杄林演替的Markov预测

森林演替是种群数量和空间分布格局随时间转移的过程,这个过程具有方向性,从初期的群落经过中间一系列演替阶段,最终达到顶级.这个过程可以概括为:     

青杄转录因子PwERF8及其启动子序列的克隆与分析

【目的】AP2/ERF是植物的转录因子家族之一,广泛参与生物胁迫和非生物胁迫过程。从青杄中克隆ERF类转录因子PwERF8及其启动子序列,研究PwERF8基因的表达特性、启动子序列功能,并进一步分析其对非生物胁迫的响应模式,为深入了解青杄的耐逆调控机制提供理论基础。【方法】通过RACE-PCR技术获得青杄PwERF8编码区全长序列。通过染色体步移技术克隆PwERF8启动子序列。通过PlantCARE在线软件和BDGP在线软件预测启动子序列上的顺式作用元件、基础启动子和转录起始位点,构建pBI121-PwERF8 promoter∷GUS启动子表达载体,采用农杆菌注射法瞬时转化烟草叶片来验证启动子的功能。构建PGBKT7-PwERF8载体,转化AH109酵母菌株验证其转录激活活性。构建35S∷PwERF8-GFP融合表达载体,通过PEG介导瞬时转化拟南芥原生质体进行基因表达的亚细胞定位分析,应用RT-qPCR技术分析该基因的组织特异性和在非生物胁迫下的时空表达特征。【结果】PwERF8基因的编码区全长序列共1 191 bp,开放阅读框共765 bp,开放阅读框翻译成255个氨基酸。在肽链的N端具有1个保守的由58个氨基酸组成的AP2结构域,在C端含有1个EAR转录抑制基序(DLNLPP)。组织特异性表达分析表明,PwERF8在茎、根、针叶、花粉、种子中均有表达,但在花粉中,PwERF8的表达量最高,其次为种子,在茎中的表达量最少。酵母单杂交试验表明,PwERF8蛋白不具有转录激活活性。亚细胞定位分析发现PwERF8蛋白主要定位于细胞核。将启动子序列进行在线分析显示PwERF8含有GA、ABA、JA和SA等激素的顺式作用元件。进一步在烟草中瞬时过表达PwERF8启动子并用GUS染色显示,PwERF8启动子能响应GA、ABA、MeJA和SA等外源激素的处理。GA、ABA、MeJA和SA分别处理青杄幼苗3、6、12 h后,PwERF8的表达量均显著高于对照,干旱、4℃和42℃处理均能诱导PwERF8表达,但盐胁迫不能诱导其表达。【结论】青杄转录因子PwERF8参与了GA、ABA、JA和SA激素的信号通路,广泛响应干旱、温度逆境等非生物胁迫,且可能作为一个转录抑制子在细胞核中发挥功能。     

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。     

我国特有植物大果青杄濒危机制的探讨

对我国特有植物大果青杄(Picea neoveitchii Mast.)在甘肃省舟曲县境内的地理分布、自然境况及种群大小等种群特性进行研究,并掌握其种子形态特征、发芽能力和物候期等生物学特性。结果表明:大果青杄在甘肃南部主要分布于舟曲县插岗乡角绕村至鬼门关之间,拱坝河两岸,种群分布狭窄,种质资源少,估算出大果青杄群落原始分布面积为81.48hm~2,大果青杄3 000余株。现有大果青杄自然集群为小种群,年龄结构不合理,种群处于衰退阶段。结实量小,病虫害严重,自然生境的破坏,土壤种子库中空种子极高是造成大果青杄种群濒危的主要原因。     

猴头菌MnP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆猴头菌 CB1锰过氧化物酶( MnP)基因,用于分析 He-mnp1基因及蛋白序列、基因的结构与功能,为研究猴头菌 MnPs基因功能、转录调控和构建优良工程菌株提供参考。【方法】根据 GenBank 中已报道的白腐菌MnPs基因cDNA序列的保守区域设计引物,采用简并PCR、逆转录RT-PCR、cDNA末端的快速扩增( RACE)等方法扩增出全长 cDNA基因序列,命名为 He-mnp1( GenBank 登录号为 HM116841.3),并对其猴头菌 He-mnp1基因进行生物信息学的分析。通过 NCBI 数据库进行 BLAST 同源搜索; ORF Finder 查找该基因的完整开放阅读框( ORF);利用Expasy数据库和BioEdit软件预测He-mnp1蛋白质的理化特性及氨基酸的组成;同时进行亲/疏水性及跨膜区的分析;采用 SignalP 4.1软件进行蛋白信号肽的预测;并利用 Clustal W 和 MEGA 5.1软件对 He-mnp1蛋白序列同源性比对和构建白腐菌MnPs系统发育树;利用数据库Conserved Domain Database( CDD)蛋白保守结构域的预测,查看 He-mnp1血红素、基质及锰、钙等结合位点;采用 PredictProtein 软件和 SWISS-MODEL 软件进行He-mnp1蛋白二级结构的预测和同源三维建模。【结果】该基因 He-mnp1的 cDNA 全长1279 bp,完整开放阅读框1080 bp,起始密码子 ATG,终止密码子 TAA,5'端非翻译区有68个核苷酸,3'端非翻译区有131个核苷酸,编码蛋白359 aa;生物信息学分析表明,猴头菌 He-mnp1氨基酸组成中丙氨酸含量最高,无酪氨酸,分子量为38.18 kDa,等电点为4.35,He-mnp1的蛋白有明显的亲水区,存在81－105、121－141间有2处疏水区域,此蛋白为亲水蛋白。He-mnp1蛋白质多肽前体包含1个18 aa的信号肽及1个5 aa的中间前导短肽。【结论】蛋白系统进化分析表明He-mnp1分布在第2组群,与平菇侧耳、冬生多孔菌、变色栓菌的 MnPs亲缘关系最为接近。He-mnp1基因存在1个保守结构域,分析显示为 Class Ⅱ类的真菌血红素过氧化物酶蛋白家族。He-mnp1蛋白二级结构预测α－螺旋占30.99%,β－折叠占3.38%,无规则卷曲占65.63%,属于稳定蛋白。He-mnp1蛋白三维建模,结果得到1个 Fe 血红素,2个 Ca2+、1个 Mn2+的结合位点及组氨酸残基等。     

日本落叶松 UDPGDH基因的cDNA克隆和表达分析

以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。     

AtMET1基因在84K杨中的遗传转化及诱导表达分析

[目的]研究拟南芥甲基化转移酶基因AtMET 1在银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系、进而实现杨树品种改良等奠定基础。[方法]以白杨派优良品种84K杨的无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtMET1基因导入84K杨基因组中;经潮霉素筛选获得抗性植株,通过常规PCR检测、DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外源基因AtMET1表达量变化。[结果]本研究共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得18株抗性植株,经分子检测证实全部为转基因植株,分别标号为AM-1～18#。qRT-PCR结果显示:化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtMET1的表达量即达到最大值,随后在处理6 h时表达量下降,处理12 h时有所回升,处理24 h后表达量降低至不足12 h时的一半。[结论]化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtMET1基因的表达,为进一步研究MET1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为今后杨树化学诱导表达研究及品种改良提供新思路、新方法。     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

AtMET1基因克隆及化学诱导表达分析

正DNA甲基化是植物基因组中普遍存在的一种的重要表观遗传学机制,对植物生长发育及进化起着重要的调节作用[1-2]。植物体DNA甲基化的建立和维持受多个基因的协同调控,其中MET1(DN-MT1-like METHYLTRANSFERASE 1 gene)是在植物中最早分离出来的甲基化相关基因,编码DNA甲基化转移酶1(MET1,Methytransferase1),该酶主要负责保持CG位点的甲基化,通过DNA甲基化作用影     

差异表达基因分离技术研究进展

研究不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下(正常状态、发育、衰老、损伤及疾病)差异基因的表达状况,将有助于了解调控细胞分化的机制,为分析生命活动过程提供重要信息。而分离与克隆差异表达的基因是了解这些生命过程的基础。1990年以来,出现了mRNA差异显示技术、代表性差异分析、抑制性削减杂交、cDNA微阵列技术等多种分离差异表达基因的手段,本文对以上方法的优缺点、发展趋势及其应用前景作了简要综述。     

杜仲IPI基因全长cDNA克隆与生物信息学分析

为解析杜仲异戊烯基焦磷酸异构酶基因序列信息和深入研究基因功能,以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出杜仲IPI基因全长的cDNA克隆。测序及生物信息学分析结果得出基因序列全长1 231 bp,共编码306个氨基酸残基,细胞定位于叶绿体。推导蛋白相对分子质量34.65 kD,理论等电点(pI)5.40,为疏水混合型蛋白质,属Nudix水解酶蛋白家族,基序类型4种,含10个潜在功能位点,三级结构以单体形式存在,主要保守基序位于分子结构中部。系统进化分析推测杜仲IPI蛋白与欧洲榛IPI蛋白亲缘关系最为接近。     

杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析

利用CODEHOP设汁CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112～651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱.疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋(40.62%)与不规则盘绕(45.31%)为主,没有发现β转角区域.     

白蜡虫β1-微管蛋白基因cDNA克隆及序列分析

采用RACE和RT-PCR对白蜡虫雌成虫β1-微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长序列为1 492 bp,完整开放阅读框为1 341 bp,编码447个氨基酸残基,包含β微管蛋白的保守区域和GTP结合位点,理论分子量约为50.20 Kda,等电点为4.75。同源性分析表明:所获得的β1-微管蛋白与其它昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,该基因cDNA序列已经递交到Genbank,获得的登录号为JF731244。     

黑杨DNA甲基转移酶基因片段的分离及表达分析

利用同源序列克隆技术,分离了三倍体黑杨中4类(MET、CMT、DRM、DNMT2)8个特异甲基转移酶片段,其中,5个片段与二倍体同源性达到100%,3个片段发生了剪切变化。通过实时定量PCR技术检测8个甲基转移酶在不同倍性、不同部位、不同生长时期间表达模式的差异,通过对5个不同部位基因表达的检测,表明不同倍性黑杨在相同的部位可能由不同种类的甲基转移酶参与主要的甲基化调控。通过分析植株从分化早期的茎尖到分化晚期的叶和茎整个生长过程中基因表达的情况,发现随着时间的推移,MET家族 (PnD1和PnD2) 基因可能是拮抗调节,CMT (PnD3和PnD4) 家族基因可能是协同调节;而隶属于DNMT2家族的PnD6基因在各部位的表达都比较弱,唯独三倍体茎尖有很高的表达。由于茎尖是生长旺盛的部位,PnD6有可能是影响三倍体速生的重要基因。这些结果可能暗示,DNA甲基转移酶基因可能参与了黑杨发育过程中叶片形态发生的过程。