溶磷草酸青霉菌筛选及其溶磷效果的初步研究

 采集石灰性土壤样品进行了溶磷微生物的筛选 ,获得了具有溶磷作用的草酸青霉菌菌株P8和Pn1。不同培养条件下测定了它们的溶磷能力 ,并与拜莱青霉菌ATCC2 0 85 1和解磷巨大芽孢杆菌ATCC14 5 81进行了比较。在固体培养基上草酸青霉菌P8、Pn1表现较强的溶解Ca3 (PO4) 2 、Ca8H2 (PO4) 65H2 O、CaHPO4、FePO4和骨粉的能力 ;在液体培养条件下 ,能有效的溶解摩洛哥磷矿粉 ,氮源对其溶磷效果有显著影响 ,硝态氮高于铵态氮 ;接种P8能够显著增加灭菌和不灭菌土壤的有效磷含量 ,灭菌土壤增加的有效磷略高于不灭菌土壤。氮源影响草酸青霉菌产生有机酸的种类 ,使用铵态氮时主要分泌苹果酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、琥珀酸 ,而硝态氮条件下几乎不再产生这些有机酸。这表明 ,氮源形态影响了它的代谢方向 ,而且它的溶磷机理不只一种 ,其机理尚不清楚 ,有待研究     

黄壤溶磷青霉菌的筛选及培养条件优化

为深入挖掘溶磷真菌在提高黄壤磷素有效性方面的作用,通过溶磷真菌筛选培养基(PVK)平板分离法从贵州安顺黄壤农田作物根际土壤中分离筛选出8株溶磷真菌。经过多次的分离纯化后,得到1株溶磷能力较强的真菌菌株G8,结合该菌株菌落形态特征和18S rRNA基因序列分析,确定其为青霉菌(Penicillium sp.),进一步研究了G8的溶磷特性及最佳培养条件。结果表明:G8以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的条件下,在磷酸三钙培养液中有效磷含量最高,为534.24 mg/L。G8在磷酸铝培养液中有效磷含量在第6天达到最大,为589.74 mg/L;G8在磷酸铁培养液中有效磷含量在第5天达到最大,为201.38 mg/L。G8在磷酸铁和磷酸铝培养液中,有效磷含量与pH值呈显著的负相关(P0.05)。通过正交试验得到G8最佳培养条件为葡萄糖含量15 g/L、接种量1%(体积比)、培养液最初pH值6、硫酸铵含量0.067 g/L。培养条件优化后G8的溶磷能力明显增强。     

霜霉菌侵染后葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库构建

[目的]构建霜霉菌侵染后葡萄叶片的酵母双杂交cDNA文库,筛选致病因子在寄主葡萄体内的互作靶标,为葡萄霜霉病菌致病的分子机理研究提供材料基础.[方法]以一年生欧亚种葡萄西拉盆栽苗为试验材料,提取并等量混合霜霉菌侵染后0、12、18、24和36 h的葡萄叶片总RNA,利用基于Gateway技术的CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒:首先将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应连接,连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建初级文库;然后初级文库质粒与pGADT7-DEST载体通过LR重组反应,重组反应产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建次级文库;再随机挑取次级文库转化Y187酵母菌株构建酵母双杂交cDNA文库;最后利用ImageJ软件和PCR反应分别统计库容量和鉴定重组率.[结果]构建的初级文库库容量为4.6×107 CFU,次级文库库容量为2.7×107 CFU,均达到构建cDNA文库的标准.酵母双杂交cDNA文库的插入片段主要集中在1000~2000 bp,且具有很好的多态性,文库质量较高.[结论]构建的霜霉菌诱导葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库符合酵母双杂交筛选要求,可用于筛选霜霉菌致病效应蛋白在寄主体内的靶标及霜霉菌侵染寄主葡萄早期抑制寄主免疫过程中的致病机理研究.     

利用体外特异位点重组反应构建黄瓜灰霉菌cDNA文库

体外特异位点重组技术应用于cDNA文库的构建,克服了传统文库构建方法中的常见问题。本研究利用这一技术,以能够分离得到植物激活蛋白的黄瓜灰霉菌(B.cinerea)菌株为材料,用TRIZOL试剂提取总RNA,从中分离纯化出mRNA,用预先接有attB2位点的Oligo(dT)引物和SuperScriptTMⅡ反转录酶合成cDNA,双链cDNA与attB1接头连接,经重组、转化后构建了其cDNA文库。文库滴度为2.3×106pfu/mL,文库总容量达2.53×107。随机挑取24个克隆,经酶切检测,平均插入片断为1466bp,重组率达100%。     

砂糖桔全长cDNA 文库的构建及病程 相关蛋白基因的克隆与分析

为从分子水平上了解影响砂糖桔生理代谢、生长发育、病虫害抗性和品质的众多基因,以无籽砂糖桔幼叶为材料,应用SMART技术构建了cDNA文库,检测文库发现其库容量达到1.36×106,重组率为95%,插入片段绝大多数分布在0.6~2kb之间,有36%的插入片段是全长cDNA。随机挑选224个克隆进行测序,获得了1个病程相关蛋白基因的全长cDNA序列。将基因序列提交Gen Bank,编号为KJ000019。基因的CDS长429bp,5′UTR为43bp,3′UTR为235bp,编码长度为143个氨基酸残基的蛋白。基因位于第8染色体上,有1个长度为193bp的内含子,基因编码的蛋白质分子量为15.4ku,等电点为6.96。该蛋白N端含有长度约为22aa的信号肽序列,指导蛋白分泌到细胞外;剩余部分是一个典型的Barwin保守结构域,具有几丁质酶的活性,在受到细菌、真菌侵染时可以分解部分真菌和细菌的细胞壁,发挥抗病作用。     

温度和干旱胁迫下绳状青霉菌P1的溶磷能力研究

【目的】探究绳状青霉菌（Penicillium funicuiosum）P1对绿豆种子萌发的作用及其在温度和干旱胁迫下的溶磷能力,为生物磷肥的研制提供菌种资源和理论依据。【方法】将绿豆种子消毒后,用沾蘸法沾绳状青霉菌P1菌悬液,置于铺有2层湿滤纸的无菌培养皿中28 ℃培养4 d,以沾无菌水的处理为对照,测定绿豆种子的发芽率、发芽势、鲜质量、干质量、芽长、根长、发芽指数和活力指数,分析P1对绿豆种子萌发的影响。测定不同干旱程度（极轻度、轻度、中度、重度）和不同温度（5,10,12,15,20,25,28,35和40 ℃）条件下P1的溶磷能力,分析环境胁迫对P1解磷能力的影响。【结果】绳状青霉P1对绿豆种子萌发具有良好的促生效果,与对照相比,绳状青霉P1使绿豆幼苗的芽长和根长分别增长了149.14%和50.21%,发芽率提高了86.67%,种子活力提升了237.25%。绳状青霉P1在干旱胁迫下仍具有很强的溶磷能力,在重度干旱胁迫下的溶磷量可达418.85 mg/L。P1在10～35 ℃的条件下均能生长且具备溶磷能力,10 ℃条件下的溶磷量为34.67 mg/L,28 ℃条件下的溶磷量为1 120.52 mg/L,35 ℃条件下的溶磷量为364.97 mg/L。【结论】绳状青霉菌P1是一株对环境适应性较好且能促进植物生长的菌株,可用于制备微生物菌肥。     

cDNA文库在棉花基因发掘中的应用

构建cDNA文库是发掘基因和研究基因功能的重要工具,也是基因组学研究的重要技术手段。棉花作为世界上重要的经济作物之一,研究人员已经构建了大量的棉花cDNA文库,为棉花基因发掘和功能研究积累了丰富的Expressed Sequence Tags(ESTs)资源。本文对近几年来cDNA文库在棉花基因发掘中的应用进行了总结。     

草酸青霉菌果胶酶诱导烟草抗TMV的研究

本试验就草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)的固态发酵提取产物——果胶酶粗酶液诱导烟草对烟草花叶病毒(TMV)的抗性进行了研究。以不同浓度果胶酶粗酶液喷雾处理2个烟草品种,超过100 U/mL的各浓度处理,病斑抑制率均达到50%以上。通过果胶酶诱导烟草抗病的时效性、加强诱导的效果、系统诱导抗病性、处理方法不同对烟草抗TMV效果以及果胶酶液对TMV病毒毒性的研究,结果表明:诱导处理2、4d后接种TMV病毒,果胶酶的诱导抗病效果最明显,病斑抑制率在50%左右;二次加强诱导处理可以提高烟草抗TMV的效果;果胶酶可诱导烟草产生对TMV的系统获得抗性;叶面喷雾果胶酶处理方法,对烟草抗TMV的效果最显著;果胶酶液中不含有影响TMV致病力的因子。由此表明,果胶酶对TMV的防治是通过激发烟草植株体内一系列抗病防御反应而增强自身抗病能力的。     

红花种子cDNA文库构建及脂肪酸代谢相关基因的克隆

【目的】构建红花种子cDNA文库,挖掘红花脂肪酸代谢途径相关基因,为红花品质改良的基因工程研究奠定基础。【方法】以红花成熟种子为材料,通过Trizol法,提取红花种子总RNA,使用GeneRacer?Kit和CloneMinerⅡcDNA Library Construction Kit试剂盒构建cDNA文库。并对cDNA文库的重组率和插入片段进行鉴定,从中获得contig和singlet片段及脂肪酸代谢相关基因,通过荧光定量PCR,测定delt-12脂肪酸脱氢酶基因在不同开花时期(14,16,18,20d)红花种子中的表达量。【结果】构建的红花种子cDNA文库总克隆数为7.5×106,重组率95%,插入片段长度均500bp,全长基因比例达到20%。从红花cDNA文库中共拼接得到contig 543条,singlet 3 444条。delt-12脂肪酸脱氢酶基因序列在成熟红花种子中的表达量较其他时期高。【结论】成功建立了红花种子cDNA文库,克隆了delt-12脂肪酸脱氢酶基因,且该基因表达量在红花种子成熟过程中逐渐升高。     

白粉菌诱导的华东葡萄环化cDNA文库中抗病基因筛选

【目的】从环化的中国华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后的叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因序列。【方法】根据植物抗病基因在氨基酸水平上的保守结构域NBS的P-loop区和LRR设计特异引物,采用三维文库筛选法,对环化的葡萄白粉菌接种诱导后的叶片cDNA文库进行PCR筛选。【结果】共建组池24个,每个组池中含有单菌落768个,包含18432个克隆。从中筛选出具有抗病基因保守序列的阳性克隆585个,其中具有NBS保守序列引物筛选出330个,LRR保守序列引物筛选出255个。对获得的阳性克隆中的插入片段进行了测序,经生物信息学分析去除重复序列后,获得422条具有抗病基因保守结构域的基因序列,其中具有NBS保守序列的250条,具有LRR保守序列的172条,共有NBS和LRR保守序列的25条。【结论】经翻译分析,其中8条编码产物包含NBS的P-loop结构域(GW787739—787742、GW787746、GW787747、GW787749、GW787758),5条编码产物包含LRR结构(GW787743、GW787744、GW787750、GW787751、GW787753),1条华东葡萄特有基因(GW787754)。从中选出具有不同抗病结构域的10条基因进行病源侵染过程中的基因实时定量表达分析,发现其中5条抗病相关基因的表达可被白粉菌接种所诱导,可能与白粉病侵染过程有关。     

鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建

【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU574736)、5′端序列B1(EU603295)、3′端序列B2(EU652768)及全长基因C(EU727171),并成功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ;生物信息学分析表明,该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高,达76%,前26个氨基酸为信号肽序列,疏水性可达2.63,由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成,其三级结构主要为β-sheet。【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌的生物信息学资源;其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达,从而获得高效工程菌株奠定了基础。     

Isolation and Characterization of Penicillium oxalicum ZHJ6 for Biodegradation of Methamidophos

One methamidophos-degrading fungus strain, named as ZHJ6, was isolated from the soils contaminated with methamidophos. It was identified as Penicillium oxalicum based on its morphological characteristics and ITS rDNA gene sequence analysis. The effects of carbon source, nitrogen source and the concentration of methamidophos, temperature and pH on the degradation were investigated. The results showed that the strain could use glucose as carbon source and the methamidophos as sole nitrogen source. The degradation ratio of methamidophos, when the initial concentration was 1.0× 10^-3 mg mL^-1, could reach above 99.9% in 12 incubation days. The strain could use ethanol, glucose, fructose, sucrose, lactose, starch, and dextrin as its carbon and energy source to degrade the methamidophos. The favorable degrading condition of the strain ZHJ6 was in a mineral salt medium at pH 5.0 and 25℃ with 1% glucose, and further studies showed that the strain could degrade folimat, phoxim and glyphosate with glucose as carbon source, but could not degrade chlorpyrifos, phosdrin, trichlorphon, and dichlorvos.     

‘变叶海棠’幼叶cDNA文库构建及CHS基因克隆

为了理解苹果类黄酮代谢的分子机制,以富含类黄酮‘变叶海棠’苹果幼叶为材料,利用SMART法构建一个苹果叶片全长cDNA文库。初级文库滴度为2.28×104 cfu/mL,库容为3.30×106个独立克隆,重组率100%,插入片段平均长度大于1.5kb。并对随机取16个重组子进行测序,经分析完整全长cDNA为7条。并从测序中获得一个查尔酮合酶（Chalcone sythase,CHS）基因,该基因cDNA全长1548bp,有一个1 170bp的开放阅读框,编码含389个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为42.44KDa,等电点5.65,该基因与已知苹果CHS基因高度同源。并构建该基因植物表达载体,用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105。     

草酸青霉菌(P-o- 41)发酵液对小麦病害的诱导抗性作用

不同浓度的草酸青霉菌(P-o- 41)[1,2]发酵代谢物处理珊西烟的一张叶片,在另外的叶片上摩擦接种TMV,比较处理叶片与无菌蒸馏水对照叶片上的枯斑数.结果表明,稀释1 000倍的发酵代谢物处理及百万分之三十八的BTH处理与清水处理对照相比,枯斑抑制率(;)分别达到84.05;和79.96; ;对小麦白粉病的诱抗效果分别达到60.88; 和69.43; ;对小麦普通根腐病的抑制率在P0.01水平上达到显著差异,而平板圆盘测定结果表明,草酸青霉菌(P-o-41)发酵液对小麦根腐病菌无抑制作用.     

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

Construction of Leaf cDNA Library of Lycium barbarum and Isolation of LycB Gene

以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATractmRNA Isolation System(Promega公司)分离mKNA,然后利用Universal Riboclone RcDNA SynthesisSystem(Promega公司)合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoR Ⅰ接头,并与λExCell载体连接,利用Packagene Lambda DNA Packaging System进行包装,在国内外首次构建出滴度为2.78×10 5pfu／ml,重组效率为88.1％的枸杞叶片cDNA文库。用Digoxigenin(DIG)标记龙胆草LycB探针,并对枸杞叶片cDNA文库进行筛选,获得5个LycB cDNA阳性克隆。释放质粒后,进行酶切鉴定,LycB阳性克隆cDNA插入片段的大小为2.1kb左右。为利用基因工程手段来调控类胡萝卜素的生物合成奠定了基础。