SPF种蛋四种蛋传外源病毒抗体检测技术标准研究

2009年5月26日国家兽医局、中国兽药协会在北京召开了"兽用生物制品产品质量研讨会",下达SPF种蛋主要蛋传外源病毒抗体检测技术标准及操作规范研究任务,由乾元浩生物股份有限公司等6家企业承担了相关研究.本文对乾元浩生物股份有限公司、青岛易邦生物工程有限公司、辽宁益康生物股份有限公司、瑞普(保定)生物药业有限公司4家企业针对网状内皮组织增生症病毒(REV)、沙门氏菌、禽白血病病毒(ALV)、禽传染性贫血病毒(CIVA)、禽呼肠孤病毒(REOV)等外源性病毒检验技术标准研究进展进行的汇总报告.     

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314 bp,建立了PCR法,其特异性和敏感性较好。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。     

禽活疫苗中网状内皮组织增生症病毒污染的检测方法比较

本研究随机抽取4种市售活疫苗,利用RT-PCR法、IFA检测法和SPF鸡检查法,检测活疫苗中的禽网状内皮组织增生症病毒的污染,比较三种检测方法的优劣以找到更好检测的方法.试验结果表明,RT-PCR法虽然方便、快捷,但RT-PCR法检测会产生假阳性,影响结果的判定;SPF鸡检查法操作简单结果可靠,但该方法试验周期较长,成...     

多重实时荧光PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒方法的建立以及初步应用

本文建立了一种快速、灵敏、特异性强的禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)检测方法,并对REV在鸡胚成纤维细胞(chick embryo fi broblast,CEF)上的增殖动态规律进行研究。分别针对gag、env以及LTR基因的保守序列设计3对引物,利用重组质粒作为模板,绘制3种不同基因的标准曲线。检测结果显示,本研究建立了多重实时荧光PCR检测方法,所制备的标准品模板在108~101copies范围内与Ct值之间呈现良好的线性关系,且最低检出量为101copies。REV感染CEF后gag、env、LTR基因的拷贝数均先减少后增多。通过实时荧光PCR技术与间接免疫荧光方法检测,发现REV在CEF上复制的初始阶段呈现病毒适应过程,此后病毒大量复制,表现出明显的增长趋势。该研究不仅为REV的诊断技术提供了一种新的方法,同时也为深入研究REV的感染机制和致病机理奠定了基础。     

部分禽源生物制品外源病毒的检测

进行了部分禽用生物制品外源病毒检测的鸡胚检查法、细胞检查法和鸡检查法。鸡胚检查法应用SPF鸡胚检验;细胞检查法主要通过鸡红细胞吸附试验、禽白血病病毒ELISA和禽网状内皮组织增生症病毒IFA检验疫苗是否含有外源鸡红细胞吸附因子、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒,并提出疫苗检验的判定标准,为各兽用生物制品生产企业新城疫疫苗的外源病毒检验提供参考。     

4种禽源病毒感染CEF后β-catenin基因的动态表达

旨在建立鸡β连环蛋白(β-catenin)m RNA的实时荧光定量RT-PCR方法,检测NDV、AIV、REV、ALV四种病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后β-catenin m RNA的动态表达水平;运用建立的Rrt-PCR方法,检测NDV F48E9、AIV H5N1、ALV和REV病毒感染后β-catenin m RNA的动态表达水平。研究结果:(1)NDV F48E9感染CEF后3 h诱导β-catenin m RNA的表达,而在感染后6 h至24 h抑制β-catenin m RNA的表达。其中接毒后的9、24 h,接毒组β-catenin m RNA的表达量分别是对照组的0.22倍和0.25倍,差异显著(P0.05);(2)AIV H5N1感染CEF后3、6 h,接毒组β-catenin m RNA的表达水平高于对照组,其中3 h时接毒组是对照组的3.14倍,差异极显著(P0.01);在感染后9、12、24 h抑制β-catenin m RNA的表达,接毒组分别是对照组的0.5、0.03、0.3倍,其中12 h时差异极显著(P0.01);(3)REV感染CEF后诱导β-catenin m RNA表达,接毒后24 h、3、5、7、8 d,接毒组分别是对照组的2.38、2.71、2.05、2.64、2.79倍,差异均显著(P0.05);(4)ALV感染CEF后诱导β-catenin m RNA的表达,其中接毒后3、5、7 d时,接毒组细胞β-catenin m RNA的表达水平分别是对照组的6.20、3.11、6.70倍,3、7 d时差异极显著(P0.01),5 d时差异显著(P0.05)。研究结论:β-catenin参与这四种病毒的感染应答,且表达模式不同。β-catenin动态表达为研究病毒感染致病与机体相互作用的分子机制提供了有价值的参考。     

SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法检测禽活疫苗中禽网状内皮组织增生症病毒

为快速、准确检测禽活疫苗中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV),根据REV p30基因上的一段保守序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成了1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法,并以常规PCR产物为标准品绘制了标准曲线,对方法的特异性、敏感性、重复性、与经典方法的符合率进行了评价。结果表明:扩增产物片段大小为222 bp,与预期片段大小相符,测序结果证实为REV靶序列;标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为1.0,扩增效率为94.2%,溶解温度Tm=(86.0±0.50)℃,无引物二聚体;该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,其他病原无扩增信号,特异性好;最低可检测26.97拷贝数的阳性标准品,比常规PCR敏感1000倍;组内变异系数、组间变异系数分别为0.79%~5.36%,1.61%~5.25%。运用建立的实时荧光PCR方法对17批禽用活疫苗进行检测,并与间接免疫荧光法(IFA)进行同步比较试验,结果两者符合率为100%。且实时荧光PCR法更快捷、更方便,结果判定更为直观可用于疫苗中REV污染情况的监测。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒（REV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

家禽活疫苗中禽白血病病毒污染检测方法比较

本研究对家禽活疫苗中禽白血病病毒的不同检测方法进行了对比,通过直接ELISA检测法、RT-PCR法、病毒分离法和SPF鸡抗体检测法,对不同来源的家禽活疫苗进行了禽白血病病毒污染的检测。通过进一步测序验证发现,直接ELISA检测法和RT-PCR检测法都可出现"假阳性"。试验结果表明,病毒分离法虽然结果准确,但是操作难度大、技术要求高,而SPF鸡抗体检测法既简单、准确,又能确切反映疫苗的纯净性,利于推广应用。     

运用实时荧光PCR法检测感染鸡种蛋中的REV

为研究通过种蛋检测的方法监测SPF鸡群REV感染情况,运用已建立的荧光定量PCR方法检测攻毒母鸡种蛋中REV,并与血清REV水平进行比较。人工感染12月龄母鸡,从种蛋中提取蛋清,接种正常鸡胚成纤维细胞后传代一次,之后石蜡密封孵化至9日龄制成鸡胚成纤维细胞（CEF）,运用荧光定量PCR方法检测蛋清,并和血清的检测结果进行比较,结果显示：83份蛋清,3份REV阳性;46份CEF,2份REV阳性,均在攻毒后的11天、14天收集,阳性样品的蛋清和CEF呈对应关系,两种方法的检测结果一致。与血清检测结果比较：阳性鸡蛋均在血清病毒血症持续的时间内采集,表明通过种蛋REV检测能反映SPF鸡的急性感染状态。本研究为通过种蛋抗原检测从而监测SPF鸡REV感染奠定基础。     

鸡痘病毒活疫苗污染禽网状内皮组织 增生症病毒的间接免疫荧光法检测研究

通过向无外源病毒污染的鸡痘病毒活疫苗中添加不同剂量的禽网状内皮组织增生症病毒(REV),然后用间接免疫荧光法(IFA)进行检测,确定了该IFA方法的最低检出量为每500羽份疫苗中污染20 TCID_(50)的REV。使用该方法对国内16家企业生产的60批鸡痘病毒活疫苗进行了检验,结果显示2个企业生产的4批疫苗REV检测为阳性。随机选取5批IFA检测阴性样品和4批IFA检测阳性样品,按鸡检查法进行外源病毒检验,结果两种方法对REV污染的检测结果的符合率为100%。     

鸡马立克氏病活疫苗外源性禽网状内皮组织增生病病毒的检测

采用免疫荧光技术检测鸡马立克氏病(MD)活疫苗中禽网状内皮组织增生病病毒(REV)的污染.将MD活疫苗稀释成每0.1ml含10羽份,同等量的MD阳性血清中和后接种于原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上,37 C 5%CO2条件下培养4d,同样条件进行培养,连续传3代.第3代时将收获的细胞培养液接种于放入盖玻片的细胞平皿中,培养4d后,用抗REV的荧光抗体37C染色60min,然后在荧光显微镜下进行观察.结果所检测的8批MD活疫苗样品均未产生荧光,为阴性,REV对照组为阳性产生了黄绿色荧光,细胞对照为阳性未产生荧光.     

鸡马立克氏病活疫苗外源性禽网状肉皮组织增生病病毒的检测

采用免疫荧光技术检测鸡马立克病（MD）活疫苗中禽网状肉皮组织增生病病毒（REV）的污染。将MD活疫苗稀释成每0．1ml含10羽份，同等量的MD阳性血清中和后接种于原代鸡胚成纤维细胞（CEF）上，37℃5％CO2条件下培养4d，同样条件进行培养，连续传3代。第3代时将收获的细胞培养液接种于放入盖玻片的细胞平皿中，培养4d，用抗REV的荧光抗体37℃染色60min，然后在荧光显微镜下进行观察。结果所检测的8批MD活疫苗样品均匀未产生荧光，为阴性，REV对照组为阳性产生了黄绿色荧光，细胞对照为阴性未产生荧光。     

禽网状内皮组织增生症病毒CA蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)DBYR1102株的前病毒基因组c DNA序列设计并合成1对引物,以p T-G质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒CA基因片段。将其克隆于pET-30a(+)中,构建原核表达质粒pET30a-CA。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并经蔗糖浓缩,Western blot法检测重组蛋白的反应原性。纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗CA多克隆抗体并对其进行鉴定。结果表明构建的重组质粒pET-30a-CA在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。经Ni柱纯化和蔗糖浓缩后得到纯度较高的融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价达1∶25 600。该研究为REV的检测及CA基因的深入研究奠定了基础。     

禽弱毒疫苗中REV低剂量污染检测方法的比较

使用污染有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的弱毒疫苗是REV感染途径之一,而通常弱毒疫苗中REV的污染剂量较低,难以检测,本研究对不同方法在检测弱毒疫苗中REV低剂量污染进行了比较研究。将定量好的REV以不同剂量分别人为污染一批商品化新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗,提取核酸后分别以TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测、常规RT-PCR检测以及PCR产物结合核酸斑点杂交检测等不同方法进行检测。结果显示常规RTPCR检测仅可检测到10TCID50/羽份的REV污染,而另外两种方法均检测到1TCID50/羽份的低剂量REV污染。将人为污染1TCID50/羽份和2TCID50/羽份REV的NDV弱毒疫苗各接种10只SPF鸡,定期针对REV抗体及其核酸进行检测,结果显示在免疫污染疫苗后7周内REV抗体全部为阴性,而核酸检测均可以检测到一定比例的阳性,提示通过接种SPF鸡检测弱毒疫苗中REV污染时,仅仅通过抗体判定可能会对一些剂量较低的REV污染造成漏检,通过结合对病原的检测有助于降低漏检率。     

ELISA法检测种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒抗体的研究

为研究种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒(REV)抗体的检测方法,运用IDEXX公司的REV抗体ELISA检测试剂盒,比较了不同提取方法、不同稀释倍数、不同洗液对卵黄中REV抗体检测结果的影响。结果显示:当用直接提取的卵黄液做300倍稀释检测,用含0.05%吐温-20的蒸馏水洗涤时,卵黄抗体的S/P比值与相应鸡群的血清抗体的S/P比值吻合度最高。应用本方法分别对50枚SPF种蛋和50枚普通鸡蛋进行检测,SPF种蛋均为REV抗体阴性;普通鸡蛋有4枚为REV抗体阳性,阳性率为8%。实验表明,种蛋卵黄ELISA抗体检测法可以代替传统血清抗体检测,为SPF鸡群的REV感染监测奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒单抗制备及在外源病毒检测中的应用

将禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜蛋白gp90(SU)的基因合成后连接至原核表达载体中进行表达,获得REV-SU蛋白,通过Ni柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得1株分泌特异性抗REV-SU蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系(2A2株),该细胞株制备的腹水与不同REV毒株具有良好的反应性,荧光效价可达1∶51200,与不同禽白血病病毒毒株和其他常见禽的病原均没有交叉反应,特异性良好。应用该单克隆抗体建立的间接免疫荧光法能检出至少5 TCID₅₀REV感染,与多克隆抗体作为检测一抗具有同等的效力,且检测背景更加纯净,适用于外源性REV检验。