猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究

为寻找猪蛔虫免疫防治的"关键"靶分子,从已构建的猪蛔虫感染期幼虫消减cDNA文库中筛选了一感染相关基因(EST编号为07E12),采用RNA干扰(RNAi)技术对该基因的功能进行了初步探讨。针对其EST序列设计了1对特异引物,体外转录合成双链RNA(dsRNA)后,通过浸泡的方式将dsRNA导入猪蛔虫感染期幼虫中,在浸泡后的4个不同时间点采用RT-PCR方法检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明,在浸泡后24、48、72 h都检测到了相对应基因表达的存在,但表达量随时间依次减少,96 h之后试验组没有检测到07E12的相应RNA的表达,提示dsRNA进入虫体并逐渐发挥了干扰作用,说明该基因在猪蛔虫幼虫感染宿主的过程中可能扮演重要角色。     

应用RNA干扰技术对猪蛔虫性别相关基因功能的初步研究

针对编码猪蛔虫雌虫卵巢蛋白基因的EST序列设计了1对特异引物及连接T7启动子的引物，经PCR扩增，获得5’端连有T7启动子的双链DNA，在RNA聚合酶的作用下，转录合成dsRNA。通过浸泡的方式将dsRNA导入秀丽新杆线虫中，在浸泡后的5个不同的时间点，采用RT—PCR检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明，在浸泡后的8～29h能检测到同源靶标的存在；而在浸泡后的43～57h不能检测到靶标RNA。另外，试验组没有观测到虫体明显的表型变化，而对照组在浸泡28h后，发现部分线虫体内有发育成形的虫卵。初步认为导入虫体的dsRNA发生了干扰效应。     

猪蛔虫感染相关基因28A02的表达谱及其全长cDNA的克隆和分析

为鉴定猪蛔虫与感染相关的差异表达基因,本实验由猪蛔虫感染期幼虫差异消减cDNA文库中挑选EST序列(28A02)为研究对象,首先,经半定量RT-PCR方法分析该基因在各期虫体的表达情况。结果显示:该基因在猪蛔虫感染期幼虫和肺三期幼虫中均有表达,并且在感染期幼虫表达丰度最高,在其它各期虫体包括雌虫、雄虫、虫卵和第四期幼虫均未检测出该基因的表达。其次,以已知的EST序列为模板,采用RACE技术获得了864 bp的全长cDNA序列,包含一个完整的长约450 bp的开发阅读框。另外,经生物信息学分析显示,该基因编码的氨基酸序列与众多物种的ATP合酶有43%～47%的相似性,推测该基因可能参与编码猪蛔虫的线粒体ATP合酶,这为进一步研究其功能奠定了基础。     

猪蛔虫不同发育阶段09G10基因的表达分析

为进一步鉴定和分析猪蛔虫感染相关基因,从构建的猪蛔虫感染期幼虫消减cDNA文库中筛选出一基因(EST编号为09G10),以肌动蛋白(β-actin)为内参,采用半定量RT-PCR方法分析该基因在猪蛔虫不同发育阶段的表达情况。通过09G10基因与内参β-actin基因的积分光密度的比值结果显示,09G10在感染期幼虫中呈现高丰度表达,在肺第3期幼虫和第4期幼虫期有微量表达,在其他各期虫体包括肝第3期幼虫、雌虫、雄虫和虫卵均未检测出该基因的表达量,表明09G10基因可能是猪蛔虫幼虫期所特有的基因,在幼虫感染宿主过程中可能扮演重要角色,为进一步研究该基因的功能提供了依据。     

猪蛔虫微管蛋白α-链基因(13E09)在不同发育期的mRNA表达研究

猪蛔虫病严重危害我国养猪业的发展,通过研究在感染期的表达基因来研究其发育繁殖机制,以达到预防和控制该病的目的已成为猪蛔虫研究的发展趋势。本研究以β-actin为内参,采用半定量RT-PCR方法鉴定分析猪蛔虫微管蛋白α-链基因(13E09)丰度随不同阶段虫体在虫体不同发育阶段的mRNA表达水平的变化,结果显示,该在感染期幼虫呈高丰度表达外,肠四期即(L4)幼虫也有多量表达,在雄虫、虫卵期也有少量表达,但在雌虫和肺三期幼虫均未检测出该基因的表达,该基因是在感染期幼虫呈高丰度表达的基因,可能在感染宿主过程中起重要作用。这为进一步研究该基因的功能提供了科学依据。     

猪蛔虫感染期幼虫抑制消减cDNA文库的构建

为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。     

牛IRF7蛋白对牛病毒性腹泻病毒增殖影响的研究

为了探索牛干扰素转录调节因子7(IRF7)基因对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)增殖的影响,试验通过慢病毒包装和RNA干扰等试验构建IRF7基因的干扰和过表达细胞模型,然后运用实时荧光定量PCR扩增和Western-blot验证过表达及干扰效果,最后用BVDV进行感染,通过E2蛋白的表达水平评估IRF7基因与BVDV增殖的关系。结果表明：BVDV感染IRF7基因过表达细胞模型12 h后,E2基因相对表达量显著降低(P<0.05),且随着时间的延长,E2蛋白表达水平逐渐降低;而BVDV感染IRF7基因干扰细胞模型8 h后,E2基因相对表达量显著升高(P<0.05),E2蛋白的表达水平在8 h后逐渐升高,即过表达IRF7基因能够使BVDV增殖水平降低,而干扰IRF7基因的表达则能够使BVDV的增殖水平增加。说明牛IRF7蛋白对牛BVDV的增殖具有抑制作用。     

日本血吸虫小RNA let-7对虫体生殖发育影响的研究

为检测日本血吸虫小RNA let-7(Sja-let-7)对虫体生殖发育的影响,本研究在日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠后的11 d~42 d,将Sja-let-7的同系物(Sja-let-7 mimics)注射入宿主体内对血吸虫Sja-let-7的表达进行干扰,结果显示Sja-let-7 mimics干扰组小鼠肝脏虫卵孵化率显著升高;小鼠肝脏肉芽肿病变减轻十分明显,病灶周围炎性细胞浸润半径变小,空泡变性较对照组轻微,周围正常组织完整性也优于对照组。扫描电镜和透射电镜未观察到虫体的明显变化。利用荧光定量PCR检测Sja-let-7的候选靶基因干扰虫体的表达情况,结果表明Sja-let-7 mimics对大部分候选基因存在不同程度的抑制作用。本研究为后续深入研究小RNA Sja-let-7的功能奠定了基础。     

RNAi技术与生物医学研究进展

随着基因组计划的实施，人类步入生物医学研究的崭新时代——后基因组时代，人们的关注点开始集中于革命性的基因新技术，RNA干扰（RNA interfereqce，RNAi）技术就是倍受关注的一个焦点。RNAi现象是指通过与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA（dsRNA）特异性抑制靶基因的转录后表达而引起的基因沉默现象。     

捻转血矛线虫感染性三期幼虫gst基因的筛选及抗干燥功能分析

为研究干燥作用对捻转血矛线虫L3期幼虫mRNA表达的影响,筛选并分析干燥相关表达基因,本试验利用mRNA差异显示技术得到了捻转血矛线虫干燥相关基因,通过相对荧光定量PCR验证所获基因的表达情况,并在秀丽隐杆线虫中通过RNA干扰抑制相关同源基因的表达检测干燥后复苏虫体生存率以研究基因抗干燥功能。结果显示,差异表达序列GH-U02A与已知捻转血矛线虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST)氨基酸同源性为94%。对秀丽隐杆线虫Ce-gst-7基因进行RNA干扰后,虫体在干燥后的生存率降低,证明gst基因在线虫中有抗干燥功能。     

寄生线虫RNA干扰研究进展

基因的RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是一个功能强大的基因组学研究工具。机体内存在特定的双链RNA（dsRNA）对基因的表达有干扰作用,可以引起基因沉默现象。通过外源dsRNA对寄生线虫进行RNA干扰研究,有助于了解不同发育期的特征现象和特定基因的生物学功能。此外,寄生线虫的RNA干扰研究对RNA干扰技术本身的发展也有较大促进作用。作者总结了近几年来RNA干扰技术在寄生线虫方面的最新研究进展,以期为相关研究工作提供参考。     

RNAi分子机制和研究方法进展

RNAi,即RNA干扰,是生物体感受双链RNA后诱导同源靶基因沉默的现象.RNAi现象最早是在对线虫的研究中发现长双链RNA(dsRNA)导致线虫同源mRNA降解,后来发现,dsRNA相比正义、反义单链RNA具有更强的基因沉默效应[1].     

RNA干扰及其在植物中的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导、能够特异沉默靶基因的转录后基因沉默现象,为植物基因功能的研究开辟了新途径.本研究主要综述了RNA干扰现象的发现、RNA干扰的过程及其特点、RNA干扰在植物中的诱导方法及载体构建、近年来R...     

RNA干扰的作用机制及应用前景

RNA干扰是将双链RNA导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程,涉及多种蛋白质共同参与。此干扰机制可在转录、转录后和翻译水平上实现。转录水平上的干扰机制是通过对靶基因染色质结构的改变,使其基因转录受限,导致表达系统的关闭。翻译水平上的干扰机制,是通过抑制相应mRNA的翻译,使相应的蛋白质表达受阻。转录后水平则包括siRNA形成阶段和扩增循环阶段。siRNA形成阶段即外源性或内源性dsRNA通过Argonaute家族基因编码的蛋白质的识别,进一步诱导双链RNA与Dicer结合。扩增循环阶段即特异性siRNA与靶mR-NA结合后,没有被活性酶切割、降解;而是以siRNA中的一条链为引物,以靶mRNA为模板,在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下,延伸形成新的双链RNA,被Dicer内切酶或相关酶切割为新的21 nt~23 nt siRNA。随着RNA干扰技术的不断进步,RNA干扰可广泛地应用到抗病毒,肿瘤治疗,药物靶点筛选以及免疫性疾病治疗等方面。     

果蝇Cullin 3基因dsRNA设计及RNAi效率检测

Cullin 3作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 3基因的功能,本实验对Cullin 3基因进行dsRNA设计,并通过PCR、体外转录、RNA干扰以及Real-time PCR等方法,检测得到该dsRNA的RNAi效率。实验结果表明:Cullin 3基因的dsRNA具有RNA干扰效果。该实验将为今后研究果蝇Cullin 3基因的功能提供一定的技术支持。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白p36基因的RNA干扰研究

本研究利用RNA干扰技术研究亚洲璃眼蜱p36基因在其生长、发育、繁殖方面的生物学功能。通过注射p36基因的dsRNA成功实现了该基因的表达沉默,干扰组表达量下降了99%。蜱p36基因沉默后,24 h的吸附率下降了50%,饱血率下降了55.5%,卵孵化率下降了100%。结果表明p36基因在亚洲璃眼蜱吸血和繁殖中具有重要作用。     

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

敲低RACK1基因抑制C2C12细胞中MyoG和MHC基因表达

本实验旨在研究RNA干扰(RNAi)RACK1基因对C2C12成肌细胞中肌分化标志基因MHC和MyoG表达的影响。将人工合成的靶向RAKC1基因的3条si RNA(1,2,3)转染C2C12细胞,用RT-qPCR方法检测并筛选干扰效率最高的1条siRNA。将筛选出的si RNA转染C2C12成肌细胞并诱导细胞分化,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光方法在mRNA及蛋白水平检测RACK1基因沉默后对MHC和MyoG表达的影响。此外,Western blot方法检测RACK1基因沉默后对PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影响。结果表明:RACK1-si RNA-2干扰效率最高,转染48 h后抑制率可达70%。随后,C2C12细胞转染si RNA-2,诱导分化48h后RTqPCR表明,MHC和MyoG的m RNA表达均显著性下调(P<0.05);诱导分化72 h后,Western blot和免疫荧光结果表明MHC和MyoG的蛋白表达明显低于对照组,但AKT和Erk磷酸化水平未见明显变化。上述结果表明,干扰RACK1能显著抑制MHC和MyoG的表达,提示RACK1正向调控C2C12成肌细胞的分化。     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）启动的序列特异的转录后基因沉默过程。