猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究

为寻找猪蛔虫免疫防治的"关键"靶分子,从已构建的猪蛔虫感染期幼虫消减cDNA文库中筛选了一感染相关基因(EST编号为07E12),采用RNA干扰(RNAi)技术对该基因的功能进行了初步探讨。针对其EST序列设计了1对特异引物,体外转录合成双链RNA(dsRNA)后,通过浸泡的方式将dsRNA导入猪蛔虫感染期幼虫中,在浸泡后的4个不同时间点采用RT-PCR方法检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明,在浸泡后24、48、72 h都检测到了相对应基因表达的存在,但表达量随时间依次减少,96 h之后试验组没有检测到07E12的相应RNA的表达,提示dsRNA进入虫体并逐渐发挥了干扰作用,说明该基因在猪蛔虫幼虫感染宿主的过程中可能扮演重要角色。     

应用RNA干扰技术对猪蛔虫性别相关基因功能的初步研究

针对编码猪蛔虫雌虫卵巢蛋白基因的EST序列设计了1对特异引物及连接T7启动子的引物，经PCR扩增，获得5’端连有T7启动子的双链DNA，在RNA聚合酶的作用下，转录合成dsRNA。通过浸泡的方式将dsRNA导入秀丽新杆线虫中，在浸泡后的5个不同的时间点，采用RT—PCR检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明，在浸泡后的8～29h能检测到同源靶标的存在；而在浸泡后的43～57h不能检测到靶标RNA。另外，试验组没有观测到虫体明显的表型变化，而对照组在浸泡28h后，发现部分线虫体内有发育成形的虫卵。初步认为导入虫体的dsRNA发生了干扰效应。     

RNAi基因沉默的动力学研究进展

RNA干扰(RNAi)是一种由小双链RNA介导的转录后基因沉默现象.在RNAi发挥基因沉默效能的过程中,许多因素都会直接或间接的影响最终的沉默效率和沉默时间.论文从siRNA类型的选择、siRNA的递送和细胞内的RNAi途径3个方面对RNAi途径中各个影响其效能发挥的因素及其解决方法做一综述,同时对描述RNAi基因沉默动力学的数学模型及其应用进行了介绍.     

猪蛔虫卵感染小白鼠试验观察

目的研究感染性猪蛔虫卵经灌胃感染小白鼠的合适感染量。方法将小白鼠分成5组,每组感染剂量分别为3 000,3 500,4 000,4 500,5 000个猪蛔虫卵。经感染后的小白鼠饲养数日,剖杀,取样压片镜检,计数。结果低剂量组A和B感染较低,C组适中,3组都未出现死亡,而高剂量组E和F出现小鼠死亡。结论小白鼠经灌胃感染猪蛔虫卵的合适感染量为每只4 000个。     

应用cDNA微阵列芯片技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因的研究

采用cDNA微阵列芯片技术，从所构建的猪蛔虫雌、雄成虫cDNA消减文库分别挑取1044和1119个克隆，PCR扩增其插入片段，经纯化后点样于预先处理好的基片上（双点杂交），制备成cDNA微阵列芯片。将分别标记荧光素Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的雌虫和雄虫cDNA探针，与制备好的cDNA芯片杂交（平行进行反标杂交试验）。根据每个点杂交后的Ratio值，筛选出双点杂交和正反标中都同时具有表达差异的基因克隆共1559个。将表达差异最明显的前831个克隆进行测序，获得720个有效序列，经生物信息学分析发现，雄虫特异表达的主要精于蛋白和雌虫特异表达的卵巢信息蛋白的基因序列多数与新杆属线虫存在同源性，有31个可能是新的ESTs。性别差异表达基因及其相关生物信息的获得为下一步研究基因功能奠定了基础。     

“害获灭”驱除自然感染的猪蛔虫试验

试验使用“害获灭”驱除猪自然感染的蛔虫 ,观察其驱虫效果和对试验动物的影响 ,如临床变化和增重等。1　材料与方法1 1　试验药品和动物“害获灭” (Ｉｖｏｍｅｃ)为商品名 ,有效成分为 1%伊维菌素注射液 ,每ｍＬ含 10ｍｇ ,剂量为 0 3ｍｇ/ｋｇ ,皮下注射。此制剂专用仔猪 ,系美国默沙杀药厂提供 ,批号ＨＣ65 70 0。试验动物为江都市邵伯镇种猪场的 60～ 80日龄仔猪。用粪便检查法从 93头猪中选出 5 0头阳性猪。1 2　试验方法1996年 4月 ,在同一饲养管理条件下 ,随机抽样分为 10组 ,每组 5头 ,分 10个圈饲养。 5个试验组 ,5个对照组。试…     

猪蛔虫感染相关基因28A02的表达谱及其全长cDNA的克隆和分析

为鉴定猪蛔虫与感染相关的差异表达基因,本实验由猪蛔虫感染期幼虫差异消减cDNA文库中挑选EST序列(28A02)为研究对象,首先,经半定量RT-PCR方法分析该基因在各期虫体的表达情况。结果显示:该基因在猪蛔虫感染期幼虫和肺三期幼虫中均有表达,并且在感染期幼虫表达丰度最高,在其它各期虫体包括雌虫、雄虫、虫卵和第四期幼虫均未检测出该基因的表达。其次,以已知的EST序列为模板,采用RACE技术获得了864 bp的全长cDNA序列,包含一个完整的长约450 bp的开发阅读框。另外,经生物信息学分析显示,该基因编码的氨基酸序列与众多物种的ATP合酶有43%～47%的相似性,推测该基因可能参与编码猪蛔虫的线粒体ATP合酶,这为进一步研究其功能奠定了基础。     

猪鞭虫与猪蛔虫混合感染的诊断与治疗

对临床送诊的病死猪,通过详细的解剖检查,及时地为猪鞭虫与猪蛔虫混合感染作出了确切诊断,从而为该病的有效治疗提供了科学依据,并赢得了宝贵的治疗时间.经过科学的用药治疗.疫情得到了有效控制,从而避免了不必要的经济损失.     

RNAi技术及其在寄生虫研究中的应用

RNA干扰（RNA inter／erence,RNAi）是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分子的介导,特异性降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,该技术自1998年首次报道以来已取得了重大研究进展。本文就RNAi的作用机制、特点及其在寄生虫基因功能研究、寄生虫疫苗及抗寄生虫药物有效靶点的筛选等方面作一综述。     

FGF10基因调节山羊成肌细胞分化相关基因表达的研究

为了阐明FGF10基因对山羊成肌细胞分化的影响,试验以简州大耳山羊羔羊的成肌细胞为研究对象,体外培养并诱导分化为肌管,采用实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因在诱导分化过程中的表达水平;同时采用腺病毒过表达和SiRNA干扰技术、形态学观察和实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因功能获得和缺失对成肌细胞中肌管形成的影响,以及分化相关基因MyoD1、Myf5、Myf6、MyoG的表达情况。结果表明:成肌细胞在分化第2～4天时,出现大量肌管,诱导分化成功。FGF10基因随着成肌细胞分化时间的延长呈现先升高后下降的趋势,且在诱导分化第2天时极显著高于分化前(P<0.01)。过表达FGF10基因时成肌细胞中的肌管形成减少,极显著下调MyoD1(P<0.01)和显著下调Myf5(P<0.05)基因的相对表达水平;而干扰FGF10基因时成肌细胞中的肌管形成增加,极显著上调MyoG(P<0.01)和显著上调Myf5(P<0.05)基因的相对表达水平。说明FGF10基因可能是山羊成肌细胞分化的负调控因子。     

FGF10基因调节山羊成肌细胞分化相关基因表达的研究

为了阐明FGF10基因对山羊成肌细胞分化的影响,试验以简州大耳山羊羔羊的成肌细胞为研究对象,体外培养并诱导分化为肌管,采用实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因在诱导分化过程中的表达水平;同时采用腺病毒过表达和SiRNA干扰技术、形态学观察和实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因功能获得和缺失对成肌细胞中肌管形成的...     

四川荣昌猪蛔虫感染情况调查

猪蛔虫是一种分布广泛,对养猪业危害严重的寄生蠕虫.我省农区从四川引进荣昌猪后蛔虫病感染情况尚未见报道.为了解四川荣昌猪蛔虫情况,笔者及兽医工作人员于2005年4月份、2006年5月份间对湟中县所引进的部分批次的四川荣昌猪进行了蛔虫感染率调查.     

猪蛔虫rAs37基因的克隆及原核表达

根据编码rAs37的已知基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术从猪蛔虫感染性虫卵的cDNA中扩增编码rAs37的部分基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定.然后阳性重组质粒转化入E.coli BL21-CodonPlus, IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定.结果显示,扩增的rAs37基因与GenBank中相应基因序列(AB078971)的同源性达100%,表达的rAs37融合蛋白表观相对分子质量约为60 000,且可被兔抗猪蛔虫免疫血清识别.说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立猪蛔虫早期诊断方法和研制猪蛔虫的亚单位疫苗奠定了基础.     

同仁县保安地区猪蛔虫感染情况调查

猪蛔虫病是由线形动物门、蛔目、蛔科、蛔虫属猪蛔虫寄生于猪小肠内引起的线虫病〔1〕。2～6月龄猪最容易严重感染,危害较大,"能引起巨大的经济损失,体重下降,食欲减退,腹泻以及猪群中出现僵猪都是蛔虫病害的症状"〔2〕;还能致蛔虫性肺炎,幼虫移行肝、肺也能造成损害,常能引起蛔虫性肠阻塞、胆道蛔虫病〔3〕等。为了了解同仁县保安地区猪蛔虫感染情况,我     

贯众化合物对人工感染猪蛔虫卵小白鼠血常规的影响

贯众始载于《神农本草经》，列为下品，味苦、性微寒，有小毒，有驱虫、止血、清热解毒的功能，临床上用于虫积腹痛、热毒疮疡、痄腮肿痛、崩漏及防治流感等。实验证明绝大多数贯众具有驱杀猪蛔虫作用。云南贯众（Cyrtomium yunnanense）是鳞毛蕨科贯众属植物，株高40—60cm，主产于景冬、新平、双柏，生于海拔1600—1900m的常绿阔叶林。根状茎直立，顶端及残留叶柄基部密被黑色、卵形鳞片。     

RNAi靶向N基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制

根据编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)基因的序列,设计3个干扰靶位(N12、N23、N26),构建siRNA表达载体,转染Marc-145细胞后接毒,测定病毒TCID50、CPE,并利用实时荧光定量PCR及间接免疫荧光检测病毒在Marc-145细胞上的复制情况。结果表明,利用RNAi技术靶向N基因,其中N12干扰靶位可以高效抑制PRRSV的增殖,证实N基因可能是病毒复制所必需的结构基因,所选的干扰靶位是病毒复制的关键性位点。     

一猪场猪蛔虫与螨虫混合感染的诊治报告

寄生虫病由于其低死亡率和其隐藏性,往往被忽视,而事实上这种损失是巨大的,寄生虫感染能掠夺猪的营养,使育肥猪生长速度下降8%~15%,饲料利用率下降13%~25%,继发其它疾病,增加诊断困难和用药成本,严重时引起猪死亡,对经济效益影响极大,据笔者对如今我当地猪场的情况了解,寄生虫中尤以猪蛔虫与螨虫对猪的感染相当普遍,下面报道的这起病例最开始畜主还以为是猪饲料出了问题,最后寻诊到笔者,我根据临床症状,     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

果蝇Cullin 3基因dsRNA设计及RNAi效率检测

Cullin 3作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 3基因的功能,本实验对Cullin 3基因进行dsRNA设计,并通过PCR、体外转录、RNA干扰以及Real-time PCR等方法,检测得到该dsRNA的RNAi效率。实验结果表明:Cullin 3基因的dsRNA具有RNA干扰效果。该实验将为今后研究果蝇Cullin 3基因的功能提供一定的技术支持。