水稻叶片质膜的纯化及质膜蛋白质双向电泳分析

采用双水相分配法和离心法对水稻叶片的细胞质膜进行了纯化.选用聚合物Dextran T 500/PEG 3350质量分数分别为6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%的双水相体系,对3次分配后的细胞质膜纯化效果进行了研究,并进行了细胞质膜标志酶H+-ATPase的活性测定、柠檬酸铅-醋酸铀双染色及电镜检测.结果表明:聚合物质量分数为6.3%的双水相体系可以获得高纯度的质膜微囊,且随分配次数的增加,可以有效减少其他内膜的污染,其质膜标志酶VO34--ATPase的相对活性高达93.5%.粗质膜经过3次两相分配后的蛋白质产率为2.73%.非离子型去垢剂Brij 58对质膜H+-ATPase的活性变化影响结果表明,纯化的质膜微囊封闭性较好,主要为正向型质膜微囊.质膜蛋白质经增溶缓冲液溶解及1-D SDS-PAGE的结果表明,纯化后的质膜有效减少了特定蛋白质条带的丰度,使蛋白质条带的分布更为均匀.双向电泳结果表明,纯化后的质膜双向电脉图谱具有低背景、高分辨率和重复性的优点,为进一步的水稻质膜蛋白质组研究提供了可靠的试验材料.     

玉米叶绿体蛋白质提取及其双向电泳体系建立

为了获得纯化、完整的玉米叶绿体蛋白质,以玉米品种郑单958为试验材料,利用差速离心与蔗糖密度梯度法分离叶绿体,并对其纯度和完整度进行检测;通过光学显微镜直接观察叶绿体的形态结构并测定过氧化氢酶的活性及Hill反应速率,证明已分离出纯度较高、完整的叶绿体。随后采用2种不同的蛋白质提取方法分别提取玉米叶绿体总蛋白质,并用Bradford法进行蛋白质定量,SDS-PAGE电泳结果表明,TCA丙酮沉淀法对玉米叶绿体蛋白质的提取不充分,而TCA丙酮与酚抽提相结合法明显比TCA丙酮沉淀法效果好,提出的叶绿体蛋白质的条带数目多,丰度较高,并得到了较理想的玉米叶绿体双向电泳图。     

适用于甜玉米叶片蛋白质组分析的双向电泳技术

采用改良的TCA/丙酮法提取叶片总蛋白,建立了一套适用于甜玉米叶片的蛋白质组学研究方法,并对蛋白溶解液、蛋白上样量、第一向IEF等电聚焦时间等条件进行了优化.用改进的蛋白溶解液提取叶片总蛋白,明显减轻了离子干扰造成的蛋白点横拖;500μg蛋白上样量的检出蛋白点最丰富,可达750个以上;延长8 000 V等电聚焦至30 000 Vh可获得良好的蛋白点分离效果;采用优化条件后的双向电泳参数,结果重复性较高,检出蛋白点的线性回归相关系数可达0.93以上.     

木本植物叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

以2种木本植物的成熟叶片为材料,对传统的双向电泳进行改进和优化,得到1种适合于木本植物叶片蛋白质电泳分析的方法,此方法大大降低了木本植物叶片中次生代谢物质对双向电泳结果的干扰,明显改善了分析效果。     

超声波辅助提取苹果叶多酚及其抗氧化性研究

研究了超声波辅助提取苹果叶多酚的最佳工艺及其抗氧化性。结果表明,超声波辅助提取苹果叶多酚的最佳条件为:乙醇体积分数20%,液料比40∶1(mL∶g),提取温度75℃,提取时间20 min,超声波功率600 W,提取两次,在此条件下多酚的得率为4.22%;苹果叶提取物有较好的抗氧化活性,对.OH和O2-.的清除能力比茶多酚强;HPLC分析表明苹果叶中根皮苷的含量为2.45%,苹果叶提取物中根皮苷的含量为6.18%,占提取物中多酚量的61.36%。     

胡杨异形叶蛋白质表达的电泳分析

[目的]研究胡杨异形叶发育的细胞与分子调控机制,揭示胡杨的生态适应性。[方法]利用SDS-PAGE及2-DE技术提取及分离同一株胡杨成年树异形叶片的蛋白质,建立适合胡杨叶片蛋白质分离的电泳技术。[结果]发现异形叶蛋白质的表达存在明显差异。由SDS-PAGE图谱可以看出,分子量为57.2,13.2,30.2,23.9,35.9及33.3 kD处的蛋白谱带差异明显。双向电泳图谱表明,胡杨叶蛋白多为分布在pH值5.0~6.5,20~40 kD之间的酸性低分子量蛋白质;共发现73个差异点,其中在锯齿卵圆形叶片中表达丰度上调的为51个点,下调的为22个点。[结论]推测在长期的进化过程中,胡杨叶片基因的调控表达发生改变而长出不同形状的叶片,以更好地适应环境。     

巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取与双向电泳分离

优化巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取方法,并用双向电泳方法分离提取蛋白,得到分辨率高和重复性较好的双向电泳图谱.在考马斯亮蓝R-250染色胶上,开花前柱头蛋白有858个蛋白点,开花后的聚合雌蕊柱头有865个蛋白点.有1个蛋白点只在开花前柱头蛋白中表达,3个蛋白点只在开花后的聚合雌蕊柱头中表达.为分析花粉和柱头间的识别奠定基础.     

Protein Extraction Methods for Two-Dimensional Electrophoresis from Baphicacanthus cusia （Nees）Bremek Leaves-A Medicinal Plant with High Contents of Interfering Compounds

Protein extraction is a critical step for two-dimensional electrophoresis （2-DE）. Different plant samples require different and adaptive protein extraction protocols. The leaves of medicinal plant, Baphicacanthus cusia （Nees） Bremek are notoriously recalcitrant to common protein extraction methods due to high levels of interfering compounds （especially the secondary metabolites and pigments）. This study was aimed to establish a routine procedure for the proteomic analysis ofB. cusia leaves, and a new protocol for the protein extraction was developed by optimizing trichloroacetic acid （TCA）/ acetone extraction method. The efficiency of this protocol was demonstrated by comparison with 3 published protein extraction methods （chloroform/acetone, Mg/NP-40, Tris-base/acetone）. The results showed that the optimized TCA/ acetone precipitation extraction method gave a relatively high protein yield （9.263 mg g^-1 fresh weight）, high-resolution separation, clear protein profiles, the highest proteins spots （1 31 t protein spots）, and displayed less contamination in 2- DE gels. Therefore, the results suggested that the optimized TCA/acetone method was the most effective among the 4 methods for B. cusia leaves.     

两种固相pH梯度胶条对桃果实蛋白质双向电泳的影响

为完善用于蛋白质组分析的双向电泳体系,以"久保"桃中果皮为试材,比较pH 5.0～8.0与pH 3.0～10.0线性范围的固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)胶条对蛋白质双向电泳的影响。结果表明:采用pH 5.0～8.0的17 cm胶条,90μg蛋白上样量,等电聚焦(IEF)电泳后,进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),银染色得出的双向电泳图有蛋白点(1 318±125)个,图谱背景清晰效果较好,适用于桃中果皮蛋白质组分析。     

烟草根系蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适于烟草根系蛋白质组学研究的样品制备方法,以栽培品种K326生长期根系为材料,比较了常规裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol抽提法和酚法等4种总蛋白质的提取方法。对制备的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)检测。结果表明:酚法最佳,所获蛋白在单向SDS-PAGE中形成条带数目多而清晰;经双向电泳分离用银染显色,可检测约548个蛋白点,图谱分辨率较好,蛋白点清晰,主要集中在等电点pH5～8、相对分子量25.0～70.0kD,可有效解析烟草根系的蛋白质组。     

胡杨异形叶蛋白质表达的电泳分析

[目的]研究胡杨异形叶发育的细胞与分子调控机制,揭示胡杨的生态适应性.[方法]利用SDS-PAGE及2-DE技术提取及分离同一株胡杨成年树异形叶片的蛋白质,建立适合胡杨叶片蛋白质分离的电泳技术.[结果]发现异形叶蛋白质的表达存在明显差异.由SDS-PAGE图谱可以看出,分子量为57.2,13.2,30.2,23.9,35.9及33.3 kDa处的蛋白谱带差异明显.双向电泳图谱表明,胡杨叶蛋白多为分布在pH值5.0～6.5,20～40 kDa之间的酸性低分子量蛋白质;共发现73个差异点,其中在锯齿卵圆形叶片中表达丰度上调的为51个点,下调的为22个点.[结论]推测在长期的进化过程中,胡杨叶片基因的调控表达发生改变而长出不同形状的叶片,以更好的适应环境. Abstract： [Objective] This study was to elucidate the cellular and molecular mechanism of the development of heteromorphic leaves of Populus euphratica Oliv.[Method]By employing SDS-PAGE and 2-demensional electrophoresis (2-DE) techniques,proteins in various heteromorphic leaves from the same adult tree of P.euphratica were isolated and separated to the electrophoresis technique suitable for the separation and analysis of proteins in leaves of P.euphratica tree.[Results]There were significant differences in the expressions of proteins in various heteromorphic leaves of P.euphratica tree.SDS-PAGE pattern showed that bands of proteins with molecular weight of 57.2,13.2,30.2,23.9 and 33.3 kDa were remarkably different.2-D electrophoresis pattern presented that proteins in leaves of P.euphratica tree mainly belong to acidic proteins distributed at pH value of 5.0-6.5 and with molecular weight of 20-40 kDa;totally 73 different protein spots were observed,of which 51 were up expressed and other 22 were down expressed in the serrated ovate leaves. [Conclusion] Based on these results,we speculate that regulated gene expression in leaves of P.euphratica tree results in the generation of different shapes of leaves,in order to adapt to the surroundings better.     

苹果花芽孕育蛋白质组学初步分析

 【目的】苹果为中国乃至世界最主要果树之一，但由于童期长、其育种工作一直落后于其它作物。本研究旨在揭示苹果花芽分化机理，缩短苹果童期，加速苹果育种进程。【方法】运用蛋白质组学研究技术（双向电泳技术、生物质谱技术、生物信息学技术）对富士苹果树短枝停长后3～9周的花芽、叶芽进行蛋白质分析研究。【结果】短枝停长后第7周花芽形态分化开始，第7周花芽较叶芽的2-DE图谱有283个蛋白点在表达上有明显的质和量的变化。4个蛋白点（16.4、30.2、40.3、65.1 kD）为花芽形态分化开始时初前（花序原始体出现）花芽2-DE图谱所特有；3个蛋白点（39.3、60.2、66.3 kD）为初后（侧花出现）花芽2-DE图谱所特有，1个蛋白点（77.1 kD）为萼片期花芽2-DE图谱所特有。对富士苹果花芽形态分化开始时的4个特异蛋白点用基质辅助激光解吸P电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行肽质量指纹谱分析，并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测，初步认为第256号（16.4 kD）、298号（30.2 kD）蛋白点是未知蛋白，第327号（40.3 kD）蛋白点是与合成酶有关的蛋白，第367号蛋白点（65.1 kD）是一个与转录有关的RNA结合蛋白。【结论】富士苹果花芽形态分化开始时有16.4、30.2、40.3、65.1 kD 4个特异蛋白、侧花出现时有39.3、60.2、66.3 kD 3个特异蛋白、萼片出现时有77.1 kD 1个特异蛋白出现。16.4、30.2 kD是未知蛋白，40.3 kD是与合成酶有关的蛋白，65.1 kD是一个与转录有关的RNA结合蛋白。     

几种提取液对苹果成熟叶片总RNA提取质量的影响

[目的]筛选一种快速有效地提取高质量的苹果成熟叶片总RNA的提取液。[方法]以红富士苹果成熟叶片为材料,用3种不同的提取液提取苹果成熟叶片的总RNA,并通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和RT-RCR检测RNA质量。[结果]3种试剂中2种可以提取出总RNA。[结论]用RNAiso-mate for Plant Tissu和RNAiso Plus搭配使用和RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue单独使用均可提取出质量较好的RNA,前者质量优于后者。     

百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立

以‘蓝色大花’百子莲(Agapanthus praecoxssp.orientalis‘Big blue’)茎尖分生组织为材料,对比研究了不同提取与裂解方法制备蛋白样品以排除多酚、多糖及核酸物质对蛋白双向电泳体系(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)的干扰。提取过程采用TCA/丙酮沉淀法和超声波破碎法;蛋白裂解过程中分别使用苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride,PMSF)和乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)、Cocktail(广谱性)蛋白酶抑制剂、核酸酶Nuclease Mix和2-D Clean-Up蛋白纯化试剂盒。制备的各蛋白样品经过7cm IPG(pH 3~10)胶条上样、电泳后发现,使用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白,裂解液中加入Cocktail蛋白酶抑制剂裂解后,用2-D Clean-Up试剂盒所制备的样品其双向凝胶电泳图谱效果最好,获得蛋白点数量最多,且蛋白等电点pI主要分布于4~8之间。随后,应用分辨率更高的24cm IPG(pH 4~7)胶条进行电泳效果的验证,蛋白点在凝胶的2个方向上均得到了较好地分离,经过ImageMaster 2-D Platinum5.0软件分析后共检测到有效蛋白点820个。本研究初步建立了百子莲茎尖分生组织蛋白双向凝胶电泳体系,为后续开展百子莲属植物蛋白质组学研究提供了重要的技术保障。     

烟草叶片总RNA提取方法的比较

[目的]研究提取烟草叶片总RNA的最佳方法。[方法]利用CTAB法、酚-SDS法和Trizol法等从烟草叶片中提取总RNA。[结果]通过紫外分光光度法和凝胶电泳检测,结果表明,CTAB法、Trizol法、RNAiso法均能得到质量较高的RNA。RNAiso法提取RNA操作步骤简单,所提取的RNA纯度好、质量高且无污染,可以进行下一步的分子生物学研究。[结论]RNAiso法最适用于烟草叶片总RNA的提取。     

适于双向电泳分析的水稻纹枯病菌菌体蛋白提取方法的比较

为建立水稻纹枯病菌菌体蛋白的双向电泳技术,获得分辨度高、重复性好的双向电泳图谱.采用了酚抽提法、TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法进行水稻纹枯病菌菌体蛋白质的提取,利用17cm、pH 5 ～8的IPG胶条对样品进行双向电泳,用PDQuest 8.0软件对电泳图谱进行分析,确定电泳的最佳参数.结果显示:采用17cm、pH 5 ～8的IPG胶条能得到较好的双向电泳图谱;同一样品的三种不同蛋白提取方法(酚抽提法、TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法)分别得到1278、885、827个蛋白质点.酚抽提法能有效去除样品中的盐分和小分子的干扰,得到背景清晰的蛋白图谱;TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法所得图谱有一定的杂质干扰,同时TCA/丙酮沉淀法和丙酮沉淀法有蛋白点缺失,尤其在碱性端存在明显缺失现泉.研究结果建立了一套适于水稻纹枯病菌菌体蛋白的可靠提取方法和双向电泳体系,为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础.     

红树叶蛋白质样品制备方法的比较及其双向电泳分析

采用水溶液提取法(磷酸盐缓冲液系统)、三氯乙酸-丙酮沉淀法和Phenol改良提取法,对红树叶进行蛋白质提取,并比较分析了这3种方法的蛋白质提取率、完整性、溶解性等。结果表明:水溶液提取法得到的是胶状沉淀,基本为多糖类物质,蛋白质含量很低;三氯乙酸-丙酮沉淀法提取的蛋白质纯度较高,但双向电泳背景最低,提取率较低,蛋白质的完整性差;Phenol改良提取法的蛋白质提取率高,约为三氯乙酸-丙酮法的10倍,双向电泳凝胶背景比三氯乙酸-丙酮沉淀法要深,蛋白质的完整性好,能够被电泳分离的蛋白质点是三氯乙酸-丙酮沉淀法的7倍左右。Phenol改良提取法在蛋白质的提取率以及完整性方面远远高于其他2种蛋白质提取方法。     

银杏小孢子叶球蛋白提取和双向电泳体系优化(Ⅱ)

以银杏小孢子叶球为材料,比较了不同的提取的方法、蛋白质裂解液组成、pH值范围以及不同质量浓度SDS-PAGE凝胶对双向电泳的影响.结果表明:TCA/丙酮/酚法比TCA/丙酮法更适合于银杏小孢子叶球蛋白的提取;含有硫脲的蛋白质裂解液Ⅱ,可显著提高蛋白质的溶解性,在2-DE图谱上可分辨出748个蛋白质点,比用蛋白质裂解液Ⅰ...