基于Illumina测序筛选牛卵泡发育相关的上调表达基因

为研究牛卵泡发育过程中促进卵泡生长成为优势卵泡的重要调控因子及其表达模式,采集牛卵巢上的最大卵泡(8～10 mm)与第二大卵泡(5～8 mm),通过测定卵泡液中雌二醇(E_2)与孕激素(P)的水平,确定优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)。刮取DF和SF中的颗粒细胞,提取其总RNA并建立文库,通过Illumina平台进行测序。用SOAP V2.0软件将测序获得的序列与牛参考基因组数据库进行比对,获得mRNA序列;用DESeq 2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,并对其中表达上调的基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最后通过实时荧光定量PCR对筛选出的具有代表性的上调表达基因进行验证。通过测序共获得32 346个基因,其中在DF颗粒细胞中表达显著上调的基因有194个。GO分析结果显示,这些表达上调的基因共分为3大类33组,其中参与生物学过程(Biological process)的基因占60.6%;与细胞组分(Cellular component)相关基因占21.2%,其中31个基因参与了细胞质功能;与分子功能(Molecular fuction)相关的基因占18.2%,其中18个基因参与金属离子结合。KEGG信号通路分析共发现4条通路,其中基因富集最为显著的是轴突导向通路。实时荧光定量PCR结果表明,细胞色素P450 19A1基因(CYP19A1)在DF颗粒细胞中的相对表达量极显著高于SF(P0.01),硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)、脑表达X2(BEX2)和丝氨酸蛋白酶35(PRSS35)基因在DF颗粒细胞中的相对表达量显著高于SF(P0.05),与Illumina测序表达趋势一致。综上,PRSS35、CYP19A1、BEX2和TXNIP在牛卵泡的发育过程中可能会起促进作用,最终引起卵泡排卵。     

秋茄(Kandelia candel L.)响应重金属胁迫的数字基因表达谱

基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)技术,对重金属污水胁迫处理组和对照组秋茄材料进行转录组测序分析。结果表明,重金属污水胁迫处理样品与对照样品相比,共筛选出的3 097个差异表达基因,其中2 202个表达上调,895个表达下调。GO功能显著性富集分析出38个GO分类条目,大量与生长发育,代谢调控,环境刺激响应相关的基因表现为富集。进一步的KEGG代谢途径分析表明,差异表达基因主要与糖类、核酸、蛋白质和脂质等生物大分子代谢、能量代谢以及次生代谢过程有关。转录因子分析发现b HLH,MYB,NAC和WRKY在重金属胁迫中发挥重要作用。此外,重金属胁迫还促进萜类、黄酮类化合物生物合成的关键酶基因(牻牛儿基焦磷酸合酶(Unigene0029352)、黄酮醇合成酶(Unigene0010384))的表达,进而促进秋茄有效成分的积累;显著诱导细胞分裂素相关基因type-b响应调节子ARR2(Unigene0033740)的表达、抑制油菜素内酯的信号转导组分基因BSK(Unigene0008986)的表达,进而提高秋茄对重金属胁迫的适应能力。实验选取了5个与环境刺激响应密切相关的基因,通过qRT-PCR验证了它们在重金属污水胁迫处理下的表达差异,结果与数字基因表达谱分析的结果较为一致,证实了差异表达基因数据的有效性。说明在重金属胁迫处理下,秋茄通过调节基因表达提高自身对污染胁迫的耐受能力。     

基于RNA-seq技术筛选山羊卵泡发育相关下调基因

【目的】对山羊优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)颗粒细胞进行高通量测序,筛选并研究与山羊卵泡发育相关的下调基因。【方法】以1岁龄贵州白山羊为供试对象,在其发情3 d后,采集第一卵泡波中的优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF),分别分离其颗粒细胞,提取RNA并进行文库构建、Illumina测序,将获得的序列与山羊的RefSeq数据库进行比对后,用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对表达下调的基因进行GO分析和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。【结果】将测序结果与山羊的RefSeq数据库比对后,共获得了33 896个基因。经DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,共获得695个差异表达m-RNA,其中462个表达显著下调,233个表达则显著上调;对462个表达下调基因进行GO分析,共分为2大类39组,其中参与生物学过程(BP)的基因占48.7%;与细胞组分(CC)有关的基因占51.3%。KEGG信号通路分析发现20条通路,其中参与癌症通路基因富集最为显著。从下调基因中筛选出6个可能会抑制山羊卵泡发育的基因,分别为PTX3、LDLR、RGN、NID1、PDLIM5、PRLR。Real-time PCR结果显示,RGN、NID1、PDLIM5、PRLR在SF与DF中的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在SF颗粒细胞中的表达量极显著高于DF(P0.01),NID1、PDLIM5在SF颗粒细胞中的表达量显著高于DF(P0.05);PTX3、LDLR在SF与DF中表达量与高通量测序结果相反。【结论】获得的6个表达下调基因在山羊卵泡发育过程中可能会抑制卵泡的发育,最终导致卵泡闭锁。     

不同抗冻保护剂对鸡精液冷冻效果及基因表达的影响

旨在研究不同抗冻保护剂对鸡精液的冷冻保存效果,并通过比较差异表达基因,以解释不同保护剂的抗冻机制.以海兰褐种公鸡为研究对象,检测了不同抗冻保护剂(保护剂Ⅰ和保护剂Ⅱ)冷冻保存后的精子活性,并利用Affymetrix表达谱芯片检测技术,对差异表达相关基因进行筛选.结果表明:1)保护剂Ⅰ组的精液冻后活力活率(27.05±1...     

卵泡刺激素对原癌基因c-myc在鸡卵泡上表达的影响

[目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用,为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层,检测c-myc mRNA和蛋白的表达;应用50 ng·mL^-1FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度,检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达;体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞,预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后,加入50 ng·mL^-1 FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡,卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比,FSH处理后,小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上,FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平...     

萝卜根径发育候选基因的初步筛选

为了鉴定调控不同萝卜品种间根大小性状差异的关键基因,利用基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)技术,对2种根直径大小不同的圆球形萝卜‘扬州圆白’(直径大)和‘萨丁’(直径小)进行差异表达基因分析。测序共获得1 468个差异表达转录本。基于基因功能注释分析,共鉴定到参与细胞壁代谢相关的转录本28个,参与蔗糖代谢相关的转录本2个,参与激素合成与信号转导相关的转录本29个。利用RT-qPCR分析对6个细胞壁代谢相关基因的表达模式进行验证,其结果与测序结果基本一致。研究发现参与植物激素合成与激素信号转导相关基因(TIFYs、DELLA、 ERF2和 CYCD3)、蔗糖代谢相关基因( ATBETAFRUCT4和 HK3)和细胞壁代谢相关基因(XTHs、EXPs和COBs)可能是调控‘扬州圆白’和‘萨丁’萝卜根大小品种间差异的关键基因。     

京海黄鸡FSHR基因组织表达谱及表达规律的研究

为探讨促卵泡素受体(FSHR)基因mRNA在不同组织中的相对表达量和表达规律,探究其调控机制,根据原鸡FSHR基因的编码序列,跨内含子设计1对荧光定量引物,采用qRT-PCR技术检测,研究组织表达谱及其在性腺轴中的表达规律。结果表明:FSHR基因在卵巢和睾丸中高表达,极显著高于其他组织。FSHR基因的表达呈不断变化的趋势,在母鸡卵巢中出壳时最高,持续下降至16周龄时最低, 20周龄稍有回升;FSHR表达量在公鸡睾丸中也于出壳时最高,持续下降至16周龄时表达量最低。在公母鸡的垂体组织中,FSHR基因表达呈小幅上升,母鸡较公鸡上升幅度稍大,卵巢中的表达量略高于睾丸。这一研究为进一步研究FSHR基因的作用机制和表达调控提供了素材。     

山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles,SF)是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3—4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装...     

牛优势卵泡颗粒细胞与膜细胞中生殖激素合成相关基因的筛选与分析

【目的】探究牛优势卵泡颗粒细胞(GCs)和膜细胞(TCs)中基因的表达差异,筛选并研究与生殖激素合成相关的基因。【方法】在GEO数据库获得GSE83524芯片数据,通过在线软件GEO2R筛选牛优势卵泡中GCs和TCs之间的差异表达基因。使用DAVID软件对获得的差异表达基因进行GO功能富集分析;使用KOBAS软件进行KEGG信号通路分析,筛选出GCs和TCs之间参与生殖激素合成相关信号通路;使用String结合Cytoscape软件构建蛋白与蛋白之间的相互作用网络(PPI)。以牛的优势卵泡为材料,采用Real-time PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。【结果】经在线软件GEO2R分析,共获得247个差异表达基因,其中43个表达上调,204个表达下调;247个差异表达基因的GO功能分析结果共分为3大类41组,其中参与生物学过程(BP)的有22组,参与细胞组分(CC)的有12组,参与分子功能(MF)的有7组;KEGG信号通路分析共发现17条通路,其中腺苷酸环化酶3基因(ADCY3)、细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)、腺苷酸环化酶8基因(ADCY8)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白基因(GNAS)、骨形态发生蛋白6基因(BMP6)5个差异表达基因参与了卵巢类固醇生成通路。经PPI网络互作分析,筛选出了前10位的Hub基因;Real-time PCR结果显示,CYP17A1、ADCY8在TCs中的表达量极显著高于GCs (P0.01);ADCY3、BMP6在TCs中的表达量显著高于GCs(P0.05),GNAS在GCs中的表达量极显著高于TCs(P0.01),这5个基因在GCs和TCs中的表达趋势与GEO芯片数据结果一致。【结论】ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6在GCs与TCs之间表达量存在显著差异,其可能在牛优势卵泡GCs和TCs中对生殖激素的合成及分泌产生了重要作用。     

牛优势卵泡膜细胞黄体化相关基因的筛选

【目的】探究牛卵巢小黄体细胞（SLCs）和膜细胞（TCs）中的差异表达基因,进而筛选与TCs黄体化密切相关的基因,为深入研究SLCs、TCs特异性及TCs向SLCs分化的机制提供参考。【方法】利用R软件limma包中的DESeq2,筛选GEO芯片数据库GSE83524数据集TCs和SLCs中的差异表达基因,再用goseq软件对筛选出的差异表达基因进行GO功能富集分析,用 kobas软件进行KEGG信号通路分析,使用String结合Cytoscape软件进行PPI网络互作分析。采集思南黄牛颗粒细胞(GCs)和TCs,以RPLP0作为内参基因,用荧光定量 PCR法对筛选出的与TCs增殖及黄体化相关的基因进行验证。【结果】共筛选获得237个差异表达基因,其中表达上调的基因115个,表达下调的基因122个。GO功能分析结果显示,参与生物学过程的有147个基因,占差异表达基因总数的53.6%,分别富集于30个组;参与细胞组分的有125个基因,占差异表达基因总数的21.4%,分别富集于12个组;参与分子功能的有98个基因,占差异表达基因总数的25.0%,分别富集于14个组。KEGG分析共发现17条通路,其中可能与卵泡内膜细胞黄体化相关的通路为FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1等4个基因参与的卵巢类固醇生成通路。经过PPI网络互作分析,筛选出了前10位的hub基因。荧光定量 PCR分析结果显示,FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B和KIF20A在SLCs和TCs中的转录水平与GEO芯片数据结果一致,表现为FSHR、CYP19A1和CYP17A1在TCs中的表达量极显著高于其在SLCs中的表达量(P<0.01),PLA2G4A、BUB1B和KIF20A在TCs中的表达量亦显著高于其在SLCs中的表达量 (P<0.05)。【结论】差异表达基因FSHR、PLA2G4A、CYP19A1、CYP17A1、BUB1B和KIF20A在牛优势卵泡TCs增殖分化形成黄体的过程中发挥关键作用。     

Gene Expression Profiling Related to Hyphal Growth in a Temperature-Sensitive Mutant of Magnaporthe oryzae

The rice blast,caused by fungus Magnaporthe oryzae,is a major constraint to the world food security.Hyphal growth is the foundation of fungal development and proliferation of fungi.To investigate genes involved in hyphal growth of this fungus,digital gene expression tag profiling was used to compare a previously generated temperature-sensitive mutant which defect at hyphae growth and reduction on pathogenicity,with its related wildtype strain.416 genes were detected as differential expression,178 of which were specifically expressed in Guy-11 but down-regulated expression in the mutant.Functional classification analysis revealed the phenotype mutation may be mainly caused by a defection in translational and vacuole- related processes.The results and the protocol used will improve our knowledge on morphogenesis and promote the further study on M.oryzae pathogenesis.     

鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达.     

利用基因芯片分析小麦茎秆伸长过程中的基因表达谱

为研究小麦茎秆伸长过程中的分子调控机制,以郑麦9023为材料,采用Affymetrix小麦基因芯片比较了小麦茎秆拔节前期及后期基部茎节组织的基因表达谱。通过对拔节后期和前期的数据比较,以共同上调表达2倍以上的基因为标准,找出了参与小麦茎秆伸长调控的候选基因172个(172个探针组);利用Affymetrix的NetAffx Analysis Center查询和NCBI的BLASTx分析,其中有29个基因已注释了功能;利用MIPS数据库将注释基因分为6类,包括转录、糖代谢、细胞组分生成、植物光合作用、病程相关蛋白基因及钙离子结合蛋白。     

鸡肉品质分析及关键风味物质和基因的筛选

【目的】对不同品种鸡肉中的风味物质和基因进行筛选,为开展品种选育及鸡肉产品的开发利用等研究提供科学依据。【方法】首先对消费者购买肉鸡的主要选择因素进行市场调查。其次分别选取上市日龄的地方品种鸡（文昌鸡、鹿苑鸡）、培育品种鸡（817肉鸡、花山鸡）、引进白羽肉鸡（罗斯308）,每个品种选取接近平均体重的30只鸡（公母各15只）屠宰,屠宰后迅速取两侧胸肌,用于品尝评定、常规肉品质、肌纤维特性、肌苷酸、脂肪酸、氨基酸含量及相关基因表达的测定。最后通过偏最小二乘法（partial least squares,PLS）将品尝评定结果与理化测定结果进行关联分析,挖掘影响品尝评定的风味物质。【结果】（1）风味是消费者购买肉鸡的主要选择因素。文昌鸡肉的甜味、鲜味显著高于罗斯308(P≤0.05)。（2）文昌鸡、鹿苑鸡平均肌纤维面积显著低于其他品种（P≤0.05）,平均肌纤维直径显著低于花山鸡、罗斯308(P≤0.05)。文昌鸡肌苷酸含量显著高于其他品种（P≤0.05）。文昌鸡、鹿苑鸡饱和脂肪酸含量显著高于其他品种（P≤0.05）,罗斯308不饱和脂肪酸含量显著高于文昌鸡、鹿苑鸡、817肉鸡（P≤0.05...     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

广西麻鸡m6A甲基转移酶基因表达与肌纤维类型及成肌分化的关系

[目的]肌纤维类型及其转化的调节是改善肉质的重要途径,最新研究表明,m6A RNA甲基化修饰在肌肉的分化中发挥着重要作用.以优良的地方品种——广西麻鸡作为研究对象,研究其性成熟日龄不同部位肌纤维类型的组成差异,探究m6A甲基化转移酶相关基因甲基化转移酶样蛋白3/14(methyltransferase like 3/1...     

鸡PTH基因克隆、序列测定及其真核表达质粒的构建

采集200日龄产蛋期新扬州鸡甲状旁腺组织,提取RNA并进行反转录聚合酶链反应（RT—PCR）,扩增产物进行T—A克隆、测序。序列测定结果表明：胛HcDNA核苷酸长度为360bp。与GenBank上发表的鸡序列比较,核苷酸同源性为99．6％,在第159位处存在C→A的有意义突变。与从GenBank下载读取的牛、马、人、狗、猫、食蟹猴PTH基因序列进行比较分析,同源性分别为51．4％、50.8％、50．6％、50.3％、50．3％和46．9％。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-PTH,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pCEP4-PTH调控机体钙代谢、改善蛋鸡生产性能和蛋壳质量的研究应用奠定了基础。     

鸡PEPT1抗原表位基因的原核表达及序列鉴定

根据GenBank的原鸡PEPT1基因保守区序列设计引物,PCR扩增得到PEPT1基因抗原表位区序列,将该序列定向克隆至pET22b(+)载体上,成功构建了pET-22b-PEPT1重组质粒。重组质粒在原核表达宿主Rosetta(DE3)中诱导表达出PEPT1抗原表位区蛋白,纯化的表达产物经过质谱分析鉴定,为进一步生产鸡肽转运载体PEPT1的特异性抗体奠定了基础。