三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

三疣梭子蟹蜕皮激素受体EcR基因的cDNA克隆及表达分析

通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,EcR基因的表达量在24h后显著低于对照组(P0.05),总体呈下降趋势;低盐(11)胁迫条件下,EcR转录组的表达量呈现先降低后上升的趋势,在12h达到最低,之后逐渐上升,在48h之后显著高于对照组(P0.05)。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析

为探究几丁质酶基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的生理作用,本研究通过转录组测序和RACE技术克隆了三疣梭子蟹几丁质酶基因（PtChi）cDNA全长（登录号：KF914663）,并通过荧光定量PCR（qRT-PCR）技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明,(1)PtChi基因cDNA全长2 200 bp,包括5’非编码区（5’-UTR）16 bp、3’-UTR 714 bp和开放阅读框1 470 bp,编码489个氨基酸,预测分子量和等电点为53.97 ku和4.76。(2)BlastP 结果显示,PtChi推导氨基酸序列与已知甲壳动物Chi-3的一致性为61%~96%,系统进化树分析表明PtChi与其他甲壳动物Chi-3聚为一支。(3)qRT-PCR结果显示PtChi基因在C期三疣梭子蟹肝胰腺中表达水平最高,胃、大颚器、心脏和眼柄中PtChi-mRNA表达水平依次降低,在其他组织中PtChi-mRNA表达量最低,且表达水平无显著差异。(4)不同蜕皮阶段,PtChi在肝胰腺、肠、胃和大颚器4种组织中的表达变化模式有所不同,肝胰腺中PtChi-mRNA表达水平在AB期最高,C期最低,暗示PtChi可能参与三疣梭子蟹蜕皮后期对病原体的免疫防御;肠中的PtChi-mRNA表达水平在E期最高,C期最低,推测PtChi参与蜕皮过程中肠道围食膜的分解和免疫功能;胃中PtChi表达水平在C期最高,暗示其参与了食物消化。以上结果表明,本研究克隆的PtChi可能为甲壳动物Chi-3型,其准确生理学功能及其在蜕皮过程中的调控机制有待进一步深入研究。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,Pt DNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后Pt DNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,PtDNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后PtDNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24 h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

三疣梭子蟹FAMeT基因克隆及其在蜕皮周期中的表达水平

法尼酸甲基转移酶(farnesoic acid O-methyl transferase, FAMeT)是甲基法尼酯(methyl farnesoate, MF)生物合成途径中最后一步的关键酶,MF是一种类似昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)的倍半萜,在甲壳动物的生长发育及繁殖过程中起到了重要作用。本文克隆得到了三疣梭子蟹FAMeT的全长cDNA序列（GenBank登录号：KC192659）,它包括一个201bp 的5非编码区、一个318bp的 3非编码区,和一个825bp的开放阅读框（ORF）,编码274个氨基酸;推导的氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物FAMeT进行比对,发现一致性达75%-97%,其中与远海梭子蟹FAMeT的一致性最高;而且该氨基酸序列由两个CF（CPAMD8/FAMeT）区域组成,这两个CF区域是FAMeT的标志,在所有甲壳动物的FAMeT里均有发现,因此推导的氨基酸序列是三疣梭子蟹FAMeT基因。我们运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法分析了其在不同组织中、不同蜕皮周期中的表达量变化,发现FAMeT在三疣梭子蟹的各个组织里均有表达且在胸神经节(Taoracic ganglia)里表达最强;在三疣梭子蟹蜕皮过程中,大颚器FAMeT在D1期表达最强,然后逐渐下降至D4最低。该结果表明FAMeT在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要的作用。     

三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因克隆及其在性腺发育过程中的表达分析

本研究利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Drosha和Exportin 5基因的cDNA全长序列,Drosha基因长度为3443 bp,编码1038个氨基酸,预测蛋白质包含2个相邻的RNA酶Ⅲ结构域(RⅢDa和RⅢDb)和1个双链RNA结合结构域(dsRBD)。Exportin 5基因全长为5000 bp,编码1208个氨基酸,预测蛋白质包含1个Importin-βN-末端结构域(IBN-N)和1个核输出蛋白结构域(XPO-1)。同源分析显示,三疣梭子蟹Drosha氨基酸序列与其他物种高度相似,与日本对虾(Marsupenaeus japonicus)相似度最高,达94%。qRT-PCR分析结果显示,Drosha和Exportin 5基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,其在卵巢和肝胰腺中的表达量最高(P0.05);在精巢不同发育时期,2个基因表达量的变化趋势一致,均在Ⅱ期(精母细胞增殖、分化期)表达量最高;在卵巢发育过程中,2个基因表达量的变化趋势也大致相同,随着卵巢发育(Ⅱ~Ⅴ期)逐渐升高。研究表明,Drosha和Exportin 5基因可能通过调控miRNA的合成来影响三疣梭子蟹性腺发育过程,为深入解析三疣梭子蟹性腺发育调控机制提供了重要参考。     

三疣梭子蟹细胞Cdk7基因克隆及其在卵巢发育中的表达

本实验应用RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)周期蛋白依赖性激酶7(Cdk7)基因c DNA序列全长。基因5′和3′非编码区域(UTR)以及开放阅读框的长度分别是23 bp、178 bp和1056 bp,预测编码一个含有351个氨基酸,分子量为39.91 k D的蛋白质,包含一个丝氨酸/苏氨酸催化保守结构域和T-loop结构。同源性分析表明,三疣梭子蟹CDK7氨基酸序列与其他物种Cdk7相似度较高,说明Cdk7基因具有很好的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,三疣梭子蟹Cdk7基因在卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。Cdk7基因在卵巢发育不同时期的表达量存在差异,其在I期和Ⅱ期的表达量显著高于其他时期(P0.05)。去除眼柄后该基因在卵巢组织中的表达呈现先升高后降低的趋势,并于第4天达到最大值。本研究的结果表明,Cdk7基因参与了三疣梭子蟹卵巢发育调控,为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物性腺发育调控机理研究提供了重要信息。     

三疣梭子蟹EcR基因的克隆及表达分析

为研究蜕皮激素受体(EcR)在甲壳动物生长和生殖过程中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA 末端快速扩增(RACE)技术,克隆了三疣梭子蟹蜕皮激素受体 (PtEcR)基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC354381),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮时期和二次卵巢发育阶段的表达特 征。结果表明,PtEcR cDNA全长2 231 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸;推导的PtEcR氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物EcR进行比对,发现一致性 达67%～97%;系统进化树分析PtEcR与其它甲壳动物EcR聚为一支,而昆虫EcR聚为另一支。PtEcR在检测的三疣梭子蟹10个组织中均有表达,其中在Y-器(YO)表达量最高。在蜕皮周期中,自蜕皮后期至蜕皮前期D2亚期PtEcR在YO中的表达量一直较低;至D3亚期和D4亚期,PtEcR表达量显著升高,这与血 淋巴中20-羟基蜕皮酮(20E)浓度在D3/D4亚期显著升高相协同,表明PtEcR在三疣梭子蟹蜕皮过程中起着重要的作用。二次卵巢发育阶段,PtEcR在YO和肝胰 腺(Hp)中的表达量自Ⅱ期逐渐升高至Ⅳ期达到最高;卵巢(Ov)中,则在Ⅰ、Ⅲ期较低,Ⅱ、Ⅳ期较高,表明PtEcR可能参与卵巢发育和卵黄发生。     

三疣梭子蟹蜕皮周期的分期

采用形态学特征观察法对三疣梭子蟹蜕皮周期的划分进行了研究,并将三疣梭子蟹蜕皮周期划分为蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮期。结果显示,根据甲壳硬度变化蜕皮后期被分成A期(身体各部位很软),B期(背甲边缘变硬,腮区、心区尚软);根据游泳足趾节末端新旧表皮基线间距/旧表皮厚度的比值(R值)结合解剖后新壳的生长状况,蜕皮前期被细分为D₀亚期(0<R≤0.4)、D₁亚期(0.4<R≤0.65)、D₂亚期(0.65<R≤0.9)、D3亚期(R≈1)和D₄亚期(R≈1,新旧壳可完全分离)5个亚期;头胸甲腹面和螯足长节背面蜕皮缝的裂开是进入蜕皮期的先兆。     

三疣梭子蟹水通道蛋白 1 cDNA 及其盐度胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用.     

三疣梭子蟹几丁质酶基因1的克隆及功能鉴定

为丰富三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶基因家族的组成,进行了几丁质酶基因1(PtCht1)的研究。PtCht1基因cDNA全长为2220 bp,编码583个氨基酸。结构域比对发现,PtCht1含有甲壳动物几丁质酶GH18家族基因的基本结构及保守序列,且进化树显示,三疣梭子蟹Cht1与拟穴青蟹(Scylla serrata)等物种的Cht1聚为一类,同源性最高,达92.80%。由此确定,PtCht1为甲壳动物GH18家族Group1基因,也是三疣梭子蟹该分类下的首个基因。此外,全组织表达分析结果显示,PtCht1在肝胰腺中较特异性高表达,且在蜕皮间期的肝胰腺中的表达量显著高于前期和后期(P<0.05)。低盐度胁迫处理后,在肝胰腺中,PtCht1基因的表达量在3 h快速升至峰值,为对照组的2.72倍;在鳃中,除12 h外,PtCht1基因的表达量均呈显著上调表达(P<0.05),最高上调9.96倍。结果表明,PtCht1基因能够参与机体对几丁质类食物的消化过程,并且在渗透压的调控等方面发挥重要作用。本研究可为三疣梭子蟹几丁质酶GH18家族Group1基因的研究奠定基础,为解析盐度影响三疣梭子蟹生长提供参考。     

盐度胁迫下三疣梭子蟹Ferritin基因的原核表达

为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。

     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3基因克隆鉴定及表达分析

为初步研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3的生物学功能,利用特异性引物扩增和SMARTTM RACE技术克隆获得三疣梭子蟹PtCht3基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析.结果显示,三疣梭子蟹PtCht3基因全长为1409 bp,对PtCht3基因序列推导出的氨基酸序列进行分析可知,该基因编码由394个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量为43.67 kDa,理论等电点为4.80.PtCht3蛋白亲水性总平均数为-0.097,属于稳定蛋白.同源性和系统进化分析发现,PtCht3与日本仿长额虾(Pandalopsis japonica)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶3的同源性分别为54％和53％,与其他甲壳动物几丁质酶3聚为一支.RT-PCR显示,PtCht3基因具有较强的组织表达特异性,在肝胰腺中的相对表达量最高,在三疣梭子蟹蜕皮前期表达上调,低盐胁迫后在鳃和肝胰腺中表达量出现了波动,总体呈先上升后下降的表达趋势.推测PtCht3可能在三疣梭子蟹消化和蜕皮过程中发挥重要作用,参与三疣梭子蟹渗透压调节进程.本研究为三疣梭子蟹几丁质酶的功能研究提供了重要信息.     

三疣梭子蟹Sox基因HMG盒的克隆分析

利用能扩增人类SRY基因HMG盒的一对简并引物,分别对三疣梭子蟹雌雄个体基因组DNA进行扩增,均得到216 bp和约400 bp的两条带,不存在性别差异,通过PCR-SSCP分析,未发现雌蟹或雄蟹所特有的Sox基因。对216 bp的带进行克隆测序得到6个Sox基因,分别命名为PTSox21、PTSox12、PTSox11a、PTSox11b、PTSox11c和PTSox4。其中,PTSox21、PTSox12和PTSox4氨基酸序列与人类Sox21、Sox12和Sox4基因的同源性分别为90%、66%和63%,PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c氨基酸序列均与人类Sox11基因有63%的同源性。此外,PTSox11a和PTSox11b的氨基酸序列之间的同源性达到了98.6%,只在第44位氨基酸残基不同。与其他物种Sox基因氨基酸序列的同源性比较发现,PTSox21与饰纹姬蛙Sox2a有92%的同源性,而PTSox12、PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c均与意大利蜜蜂的Sox1有73%的同源性,PTSox4与意大利蜜蜂的Sox1有72%的同源性。