不同探针大小、标记物及反应底物对马铃薯类病毒杂交检测的影响

 灵敏可靠地检测马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)对脱毒种薯的生产具有重要意义。本研究探索了影响核酸杂交检测技术的关键因素。通过基因克隆技术构建了插有PSTVd全长单体、双体及片段的载体。分别以地高辛和同位素为标记物,利用PCR和转录标记技术制备cDNA和RNA探针。比较探针大小、标记物、标记方法、反应底物等对检测灵敏度的影响。结果显示,以地高辛为标记物,利用PCR标记制备的PSTVd双体cDNA探针,在以CDP-Star为底物,通过在柯达X-OMAT BT胶片进行化学发光反应来分析结果的检测灵敏度最高,可以检测到0.05 pg总RNA中的PSTVd,是国外报道检测灵敏度的500倍。利用核酸斑点杂交技术检测PSTVd具有灵敏度高,一次可检测样品数量多等特点,对于大规模PSTVd检测更加方便可行。     

地高辛标记的cDNA探针检测烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒及马铃薯Y病毒

 根据已发表的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,分别以提取的TMV、CMV和PVY侵染的病叶总RNA为模板,反转录PCR进行体外扩增,分别得到长度为0.44、0.77、0.80 kb的目的片段,并克隆到pGEM-T easy质粒载体上,以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的双链DNA探针。以合成的探针通过斑点杂交技术检测烟草病叶总RNA和烟草病叶汁液。TMV、CMV和PVY的3种地高辛探针检测各自感染的烟草病叶总RNA的稀释低限分别为1:1000、1:10000、1:320,检测各自侵染烟草病汁液的最大稀释倍数分别为1:100、1:100、1:10,而每种探针与健康烟草和其它2种病毒的反应均为阴性。     

辣椒轻斑驳病毒葫芦岛分离物RNA杂交检测体系的建立

辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)可引起辣椒叶片以及果实的花叶和畸形症状,造成相当的经济损失。为了建立辣椒轻斑驳病毒的高特异性和灵敏度的分子检测体系,采用非放射性的化合物地高辛(DIG)标记检测PMMoV正义链的RNA探针,建立了该病毒Dot blot杂交和Northern blot杂交检测体系,并通过RT-PCR法验证了杂交体系的检测特异性。结果表明,RNA探针对PMMoV具有很高的检测特异性和灵敏度,适用于病毒的早期检测以及相关分子研究。     

基因芯片在百合无症病毒检测中的应用

设计百合无症病毒、植物18SrRNA基因的特异扩增引物和各种对照的探针，将探针固定在醛基化玻璃片基上，完成植物基因芯片制备。提取百合种球总RNA，经RT-PCR扩增相应区段并用Cy3dCTP进行标记，用标记的PCR产物与芯片杂交，扫描仪对杂交结果进行扫描，GenePixProd．0软件对杂交图像进行分析。结果从荷兰进口的百合种球中检测出百合无症病毒，证明了该实验研制的植物病毒基因芯片的准确性和灵敏性。     

10种植物病毒的基因芯片检测技术研究

 本研究设计了10种植物病毒和各种对照的探针, 将探针固定在醛基化玻璃片基上制备基因芯片。用常规的Trizol法提取植物总RNA, 根据病毒的外壳蛋白基因或复制酶基因设计特异性引物, 经RT-PCR扩增相应区段并用Cy3-dCTP进行标记。将标记的PCR产物与芯片杂交, 扫描仪对杂交结果扫描, GenePix Pro 4.0软件对杂交图像进行分析。结果表明, 该芯片可以从病毒感染样本中检测到特异性识别信号, 检测灵敏度比RT-PCR高10~100倍, 所以, 基因芯片能对植物病毒作出快速、准确的检测。     

黄瓜花叶病毒分离物核酸酶保护试验(RPA)方法的株系分化研究

 采用黄瓜花叶病毒((CMV)亚组Ⅰ株系Fny-CMV及亚组Ⅱ株系Ls-CMV的RNA₂的特定序列片段的cDNA克隆,体外转录,同时掺入³²P标记制备负链RNA探针,再与纯化的甜椒上的CMV中国分离物的RNA进行杂交,检测其与探针之间的同源性。共检测样品分离物3份。试验结果表明:河南新乡和北京密云的CMV甜椒分离物与Fny-CMV的核苷酸有高度同源性,隶属于Fny-CMV为代表的亚组Ⅰ株系。来自福建的样品与亚组Ⅱ的Ls-CMV株系有高度同源性,隶属于CMV亚组Ⅱ株系。本试验同时利用源于我国CMV亚组Ⅰ的K株系的RNA₂两个EcoR Ⅰ位点间1657-2125 nt的核苷酸序列为探针,同样与以上3份CMV中国分离物进行RNA杂交,进一步比较分析了这几个分离物与我国亚组Ⅰ的K-CMV株系的关系,证明了我国CMV存在亚组与株系分化。     

侵染‘舞美’苹果的苹果锈果类病毒检测与全序列分析

2017年9月,在山东胶州调查苹果病毒病时发现‘舞美’果实表现出明显的花脸症状,取发病树体芽组织嫁接于健康‘富士’苹果幼树上,采用RT-PCR技术对其是否含有苹果锈果类病毒进行了检测,并利用DNAMAN、MEGA 5.1等软件对其全序列进行了分析。结果表明,显症‘舞美’果实、发病树体枝条及嫁接‘富士’枝条中均可检测出ASSVd,无症状‘舞美’果实和相应树体枝条中均未检测到ASSVd。‘舞美’分离物基因组主流序列为333 nt (登录号MG745387),与GenBank中已报道的ASSVd序列一致性为92%～99%。序列多重比对及系统进化树分析发现,该分离物的末端保守区和中央保守区与ASSVd参考序列一致,且与不同来源的ASSVd分离物亲缘关系较近。这是首次在‘舞美’苹果上发现和鉴定出苹果锈果类病毒。     

桃潜隐花叶类病毒RT-PCR和分子杂交检测技术的建立

本研究从武汉周边采集表现典型花叶症状的桃样品,提取总RNA为模板,采用RT-PCR方法对这些样品进了分析,结果显示所分析的5个样品(P1～P5)均获得了预期大小约为337bp的目标扩增条带,表明样品均带有PLMVd.通过回收RT-PCR产物,用生物素标记制备探针,分别采用DNA斑点杂交、RNA斑点杂交和组织印迹杂交3种杂交方法对这些样品进行检测比较,3种杂交方法中,组织印迹杂交操作步骤相对简单快捷,适合于对PLMVd进行大田快速检测.     

苹果锈果类病毒山东栖霞分离物的分子鉴定及序列分析

本研究以采自山东省栖霞市的两个苹果样品为试验材料,利用二维电泳、斑点杂交、RT PCR等分子生物学技术对样品中的苹果锈果类病毒(ASSVd)带毒情况进行了检测。结果表明：两个样品均携带ASSVd。对两个样品中的ASSVd进行克隆测序,并利用生物学软件DNAMAN对所得序列进行分析,结果表明：与世界上首次报道的ASSVd序列(X17696)相比,本研究所得到的ASSVd序列变异较小,相对比较保守。     

北京平谷区苹果锈果类病毒检测初报

采集北京市平谷区‘中秋王’、‘寒富’苹果叶片样品共12份,以Northern杂交、RT-PCR方法检测苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)带毒情况。结果表明,表现明显锈果症状的‘中秋王’样品均检出ASSVd,无明显症状的‘中秋王’样品没有检出ASSVd,而无明显症状的‘寒富’样品全部携带ASSVd。测序发现,所得序列与NCBI中已报道的ASSVd基因组序列相似性为91%~99%,且两品种中ASSVd主流序列完全相同。结果说明‘中秋王’对ASSVd较为敏感,感病后易于表现出明显的锈果症状;‘寒富’对ASSVd耐性较强,感病后不表现出明显症状。     

Molecular characterization and variability analysis of <Emphasis Type="Italic">Apple scar skin viroid</Emphasis> in India

Apple scar skin viroid (ASSVd) infection is a major limitation to apple fruit quality and causes huge economic losses. In surveys of apple orchards in the northern Indian state of Himachal Pradesh, fruits with dappling symptoms were noticed. ASSVd was detected from these fruits and molecularly characterized. Ten clones from three isolates were sequenced, of which seven were new sequence variants of ASSVd. The clones had significant sequence variability (94–100%) with each other. Variability was more common in the pathogenic domain of the viroid genome. Four of the clones were 330 nucleotides (nt) long, and the other six had an additional nucleotide. Phylogenetic analysis showed close affinity of the present isolates with some Chinese and Korean isolates. The study reports seven new variants of ASSVd and also provides the first molecular evidence of viroid infection (ASSVd) in apple in India.     

侵染小苹果的苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

小苹果是抗寒海棠类与大苹果的杂交后代,因耐寒能力强,口感好,被广泛用于嫁接与育种材料,是我国寒凉苹果产区宝贵的种质资源。苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)侵染苹果后引起果实表面产生锈状斑、花脸、畸形等症状,严重降低果实品质和市场价值。2013年在调查苹果病毒病时发现北京市延庆县种植的小苹果表现出典型畸形症状,应用RT-PCR方法对其进行检测后经测序和序列分析表明,小苹果被苹果锈果类病毒侵染。克隆此分离物(ASSVd-YQ)全基因组序列,分析后得到其基因组全长为329个核苷酸,系统发育分析表明该分离物与来自不同国家和地区的ASSVd分离物间的进化关系极近。二级结构预测表明,该分离物的中央保守区与末端保守区与ASSVd参考序列相同。这是对侵染小苹果的ASSVd的首次检测和鉴定。     

我国部分苹果产区苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

近年来,由苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)引起的苹果花脸病、锈果病在我国一些苹果产区日趋严重,对我国苹果生产和苹果产业发展造成严重危害。为了解ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况,采用RT-PCR对陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江6个苹果产区的35份苹果样品进行检测,并克隆获得30个分离物的基因组全序列,大小为330~333个核苷酸。分析表明,这些分离物的基因组全序列与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列相似度为96%~100%,在苹果锈果类病毒属的末端保守区及中央保守区保守,在致病区和左端区域有突变,一些分离物的突变位点相同。系统发育分析表明分离物因相同的突变位点而聚类,而与地理来源无关。     

Characterization of a new Apple dimple fruit viroid variant that causes yellow dimple fruit formation in ‘Fuji’ apple trees

A 303-nucleotide viroid was isolated from an apple tree (Malus × domestica, ‘Fuji’) cultivated in Japan. The viroid had 84.9% overall nucleotide sequence homology to Apple dimple fruit viroid (ADFVd), a member of Pospiviroidae, reported from Italy. This viroid differed from the Italian variant by 47 mutations (38 substitutions, six deletions and three insertions), and most of these mutations occurred on either side of the central conserved region. The leaves and branches of the infected trees did not have any disease symptoms, but the fruits were dimpled and yellow. The infected scions were top-grafted onto a healthy ‘Fuji’ apple tree, which tested positive for this viroid in a northern hybridization analysis, and yellow dimple fruits were produced in the second growing season. We propose that this viroid is a new variant of ADFVd and causes yellow dimple fruit formation in ‘Fuji’ apple trees.     

苹果锈果类病毒(ASSVd)的种群及遗传变异分析

苹果锈果类病毒apple scar skin viroid(ASSVd)引起苹果锈果病,是限制我国苹果生产的重要因素之一。然而,目前对ASSVd全球种群的组成及遗传变异仍缺乏足够的了解。为此,本研究对GenBank中登录的212条基因组序列进行了比较、变异分析以及系统发育分析。确认ASSVd的种群符合准种模式,由165种序列相似但不相同的变体组成。以来自我国苹果的MW315909和MW302328为代表的两种变体的数量最多,是主流变体。依据参考序列(NC001340)分析碱基变异,发现碱基变异偏好于某种碱基,并且偏好于基因组上的一些特定位点。变异不仅发生在基因组二级结构的左末端区、致病区、中央区,也发生在可变区和右末端区。值得指出的是,基因组上有4个区域极少发生变异,为保守区。其中的两个保守区(末端保守区和中央保守区)是已知的,而在可变区与右末端区交界处的两个保守区是新发现的,它们对ASSVd的复制和移动可能具有重要作用。这些结果不仅有助于掌握ASSVd的发生及流行,而且为研发RT-PCR/qPCR检测技术提供了参考,为研究ASSVd与寄主的相互作用提供了线索。