番鸭细小病毒YL08株VP1基因的克隆及序列分析

为明确番鸭细小病毒结构蛋白(VP1)基因的分子特征,本研究利用PCR方法从番鸭细小病毒(MDPV)黑龙江分离株YL08中扩增出VP1基因,并对其进行了克隆测序和分析。基因测序结果表明:MDPV YL08株VP1基因全长为2 199 bp,编码732个氨基酸;MDPV YL08株VP1基因与国内外其他已发表的MDPV分离株核苷酸序列的同源性为92.7%~95.8%;系统进化树分析表明:MDPV各分离株在遗传进化上存在较为明显的地域性。本研究中MDPV YL08株与其他MDPV中国大陆分离株处于不同的分支,提示其可能具有独特的遗传起源。     

基因重组型番鸭细小病毒FJM3的全基因组特征

从1例未免疫雏番鸭细小病毒活疫苗与鹅细小病毒活疫苗的临床病死雏番鸭脏器中成功分离到1株番鸭细小病毒(FJM3株)。为明确其基因组特征,运用PCR方法,扩增出番鸭细小病毒FJM3株全基因组。结果表明,FJM3株基因组全长为5017nt,其基因组结构和经典番鸭细小病毒参考毒株一致。序列比对结果表明,FJM3株全基因组序列与GenBank中登录的经典MDPV参考株(FM株)核苷酸序列同源性为94.0%,与番鸭源GPV参考株(Y株)核苷酸序列同源性为85.6%。全基因组遗传进化分析表明,FJM3株处于MDPV遗传进化分支;VP1基因遗传分析表明,FJM3株处于经典MDPV遗传进化分支;VP3遗传进化表明,FJM3株处于GPV遗传进化分支。对FJM3株和参考株(FM株、Y株和SYG61v)进行遗传重组分析表明,该毒株于存在2处MDPV与GPV的基因重组现象。     

鸭源新型鹅细小病毒DS15株生物学特性研究

试验对鸭源新型鹅细小病毒(Duck derived goose parvovirus,DDPV)DS15株在鸭胚上的增殖特性及对鸭胚的致病力进行了研究。结果显示,鸭胚接种DDPV DS15株以后,96~120 h出现死亡,胚体全身出血,病毒滴度ELD50为10-5.5/0.2 m L。以鸭胚增殖的病毒攻击樱桃谷肉鸭,复制出典型的鸭"大舌病"临床症状,并从发病鸭脏器中分离到病毒。对DDPVDS15株VP2基因进行克隆并并将其因序列与国内外报道的部分鹅细小病毒(GPV)及番鸭细小病毒(MDPV)分离株的VP2基因进行比对和分析。结果表明,DS15株VP2基因与GPV之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.2%~96.5%和93.4%~97.8%,而与MDPV核苷酸和氨基酸同源性则较低,分别为80.1%~89.3%和87.8%~93.5%;在亲缘关系方面,DDPV DS15株与GPV较近,提示二者可能是由同一病毒进化而来。     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV FS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上,MDPV FS株基因大小为1764bp,编码528个氨基酸,对插入片段进行序列测定。结果表明,我国分离的MDPV FS株基因序列与国外发表序列的同源性为98.6%,与已发表的YZ株同源性为99.5%,可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的序列分析

将番鸭细小病毒强毒株MDPV－Q经番鸭胚传代，获得致弱株MDPV－26，应用PCR技术扩增MDPV－26株的VP2基因片段，将扩增后的VP2基因重组到pMD 18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，将测定结果及由该结果推导的氨基酸序列分别与MDPV－Q株及国外已发表的MDPV相应序列进行同源性比较及分析，结果表明，MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列及与国外分离株均具有很高的同源性。     

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列,应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上,经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明,MDPV XX株基因大小为1764bp,编码587个氨基酸,其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%,而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守,且和同属的小鹅瘟病毒明显不同,这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。     

番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析

为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征，本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因，并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对。序列分析显示，克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因，分别为1 884 bp和2 199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高，而NS基因则较为保守；进化分析显示，安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支，二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近，可能来源于同一毒株，与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远；安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致。两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高，与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH1401同源性也在99.5%以上；与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低，其中VP基因仅为88.9%、89.3%。本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高，但仍存在一定程度的基因变异，增...     

免疫鸭群中一株变异型番鸭呼肠孤病毒的分离与特性研究

本研究从广东省某发病番鸭场分离得到的呼肠孤病毒(DRV)混合有番鸭细小病毒(MDPV)疫苗株.采用MDPV阳性血清中和后,经2轮番鸭胚有限稀释克隆获得纯化的DRV.电镜观察病毒粒子呈球形、无囊膜、双层衣壳、直径约70 nm.F6代病毒滴度为log107.5 TCID50/0.1 mL,病毒能够致番鸭胚成纤维细胞产生细胞病变,并能够致死番鸭胚和SPF鸡胚,回归1日龄雏番鸭出现典型的肝脏点状或斑块状出血等特征性病变,与临床发病鸭相同.分离株S3基因核苷酸同源性与太湖流域2011年分离株DRV-TH 11最高,为99.9％,与福建番鸭源分离株MDRV-J 18为98％;与早期MDRV在66.8 ％～67.2％之间,处于不同进化分支上.本研究分离株对番鸭胚、SPF鸡胚及雏番鸭致病力强,而且其基因序列比早期分离株变异较大,应加强监测并及时筛选新疫苗株以有效防控该病的发生和蔓延.     

“短喙侏儒综合征”半番鸭病原学检测及病理组织学特征

旨在明确福建省漳州地区3个"短喙侏儒综合征"半番鸭群的病原及病理组织学特征。对患病半番鸭体质量、喙长、喙宽进行测定及统计分析,采集患病半番鸭肝、脾、胰腺组织进行病原学检测、病毒分离鉴定和基因序列测定与分析,同时采集心、肝、脾、肺、肾等10种组织进行病毒分布及病理组织学研究。结果表明,患病半番鸭喙长,体质量与同场正常未感染半番鸭相比,发病鸭体质量减少达49.00%,喙长缩短达32.00%,喙宽缩短达22.00%;经PCR或RT-PCR检测显示,所采样品禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、呼肠孤病毒、鸭圆环病毒、鸭疫里默氏菌、鸭大肠杆菌、鸭沙门菌均为阴性,均为水禽细小病毒阳性;对组织匀浆液致死的鸭胚尿囊液检测表明,分离毒株均为水禽细小病毒,经进一步基因序列分析显示所分离3株病毒与番鸭细小病毒病(MDPV)各代表株核苷酸同源性达97.7%以上,与新型MDPV SAAS-SHNH株核苷酸同源性高达98.9%。组织病毒分布检测结果显示,患病半番鸭心、肝、脾、肺、肾等10种组织均不同程度带毒,其中以胸腺、法氏囊、心、脾和胰腺病毒含量最高,肝、肺、脑、小肠次之,肾脏最低;病理组织学研究可见心肌颗粒变性,肝脏水泡变性,胸腺出血,骨骼肌出血、坏死。以上结果表明,福建省漳州地区的3个半番鸭群发生的"短喙侏儒综合征"由新型MDPV所致,且与经典的MDPV在感染宿主、临床症状、病变特征等方面存在较大差异,为新型MDPV病的诊断提供了科学依据和借鉴。     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

番鸭细小病毒VP3基因克隆和序列分析

为研究番鸭细小病毒基因遗传变异特征,通过PCR技术获得了番鸭细小病毒结构蛋白基因VP3序列AH-MDPV-VP3,并将该序列与GenBank数据库中登录的9条番鸭、鹅和鸭细小病毒基因相应序列进行了比对分析。测序结果可见番鸭细小病毒VP3基因全长1 605bp,编码534个氨基酸。氨基酸序列同源性和进化分析表明AH-MDPV-VP3与国内两个番鸭细小病毒基因KC171936和KM093740同源性较高,分别为100%和98.3%,且三者之间亲缘关系较近,来源于共同祖先;而与鹅细小病毒,尤其与台湾分离的鸭细小病毒基因AY382891和AY382892同源性相对较低,分别为91.6%和90.8%,遗传距离也相对较远。同时可见番鸭、鹅和鸭细小病毒的VP3基因各自较为保守,仅有少数氨基酸发生变异。本研究初步获得番鸭细小病毒VP3基因分子特征,为下一步该基因在免疫诊断及免疫防治中的应用奠定了基础。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物，应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR3.1T载体上，MDPV YZ株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，并对播入片段进行序列测定。测定结果表明，我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的分子克隆与序列测定

将番鸭细小病毒（MDPV）强毒Q株经番鸭胚连续传代，获得致弱株MDPV－26，根据已发表的MDPV的全基因序列，设计了1对引物LHMP7／LHMP8，同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶Sac Ⅱ和KpnⅠ的酶切位点，应用PCR技术扩增了MDPV0－26株的VP2基因片段，将扩增后的基因片段重组到pMD18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，测序结果表明，弱毒株MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列相同率达99．7％，与国外分离株的同源性为98．3％，说明强，弱毒株的VP2基因序列变化不大。     

2008年-2009年广东番鸭细小病毒分子流行病学研究

VP2基因是番鸭细小病毒(MDPV)的主要免疫原性基因,其编码的VP2蛋白能够诱导机体产生中和抗体。本文对2008年～2009年从广东各县市分离、鉴定的11个MDPV野毒株VP2基因进行克隆测序,并对获得的VP2基因序列进行比较和分析。结果表明:11个不同分离株之间核苷酸序列同源性为98.7%-100%;与6个国内外参考毒株同源性为97.7%-99.6%;所有毒株都含有4个完全相同的潜在糖基化位点;说明该病毒保守度高,仅有个别的点突变。将分离株SL2连续传70代获得致弱毒株SL-70,动物实验结果表明SL70株对雏鸭无致病力;经测序发现SL-70与其祖代分离株SL2的VP2基因序列同源性高达99.9%,仅发生了18个碱基的点突变。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

种鹅源鸭甲肝病毒1型的分离鉴定及其VP1基因分析

从病死的朗德种鹅肝脏中分离到1株可致鸭胚死亡的病毒,该病毒无血凝活性,其基因可被鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)特异性引物所扩增,但不能被鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒特异性引物所识别,因此将其暂命名为种鹅源鸭甲肝病毒1型JX1405株。将该株VP1基因扩增产物回收后克隆,序列分析表明JX1405株与DHAV-1参考株的同源率高达91.6%~99.3%,与DHAV-2参考株的同源率较低,仅为69.4%,和DHAV-3参考株的同源率为71.2%~72.5%,遗传进化分析表明JX1405株与DHAV-1关系密切,它们在进化树中共处同一分支。     

新型鹅细小病毒信阳株的全基因组扩增及遗传进化分析

为了解信阳地区新型鹅细小病毒(NGPV)的遗传变异特性，对疑似NGPV感染麻鸭病例进行病原检测，采集肝脏和脾脏无菌处理后接种SPF鸭胚，成功分离到1株NGPV,命名为HNXY21株，并对其进行全基因组序列分析和VP1基因重组鉴定。序列比对和系统发育树表明，分离株HNXY21和其他9株NGPV同处于鹅细小病毒(GPV)组内的一个独立分支上，与山东分离株SD0316(GenBank登录号：MN415969)核苷酸同源性最高；VP1蛋白的氨基酸序列分析显示，与经典GPV和番鸭细小病毒(MDPV)相比，有8个氨基酸位点突变；通过Simplot软件对VP1基因进行重组分析表明，分离株HNXY21 VP1基因存在重组信号，其潜在的主要亲本为山东分离株SD0316和弱毒疫苗株SYG61v。本研究结果丰富了NGPV的分子生物学资料，为进一步研究NGPV的致病机制奠定了基础。     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析术

摘 根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计1对引物，应用PCK技术扩增MDPVFS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上，MDPVFS株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，对插入片段进行序列测定。结果表明，我国分离的MDPVFS株基因序列与国外发表序列的同源性为98．6％，与已发表的YZ株同源性为99．5％，可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。     

樱桃谷肉鸭短喙长舌综合征病原的分离鉴定

2015年3月以来,我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病,该病以鸭喙发育不良,舌头外伸为特征。根据症状,暂将该病命名为鸭短喙长舌综合征(duck beak atrophy and dwarfish syndrome,BADS)。从不同地区5个发病肉鸭群采集130余份样品,取5份样品进行病原的分离。细菌培养结果均为阴性(4株大肠杆菌从肝脏常规分离);获得5份鸭胚培养物。该培养物不能凝集鸡红细胞。对5株分离株株进行PCR检测,结果显示鸭瘟病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒、鹅多瘤病毒、鹅腺病毒、禽网状内皮组织增生征病毒等均为阴性,鹅细小病毒呈阳性。采用基于鹅细小病毒VP3基因的PCR方法对74份样品(肝脏和泄殖腔棉拭子)进行检测,阳性率为100%。该分离株661bp的VP3核苷酸序列与鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行分析,结果显示该分离株与鹅细小病毒82-0321v株和SHM319株亲缘关系最近,核苷酸同源性分别为98.8%和98.3%;与番鸭细小病毒同源性较低,在77.6%~78.8%之间。用鸭胚分离的SDLC01株感染1日龄雏鸭能引起鸭上、下喙萎缩、舌头外伸等症状。上述结果表明,从BADS患鸭体内分离得到鸭细小病毒(duck parvovirus,DPV),其可能与BADS具有相关性。