鸭瘟病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,经优化反应体系,建立了LAMP快速检测方法.结果表明,LAMP方法能够在63℃恒温下,1h内实现目的核酸的大量扩增.结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreen Ⅰ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化.该方法敏感性可达0.245 μg/L,比普通PCR灵敏性高10倍;对鸭病毒性肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应;利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30％.该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法.     

布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物（1对内引物、1对外引物）,进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.     

环介导等温扩增(LAMP)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒的VP2基因序列,设计并合成了6对特异扩增禽脑脊髓炎病毒VP2基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,对采集的禽临床样品的核酸分别进行了检测.结果表明,该法只检出禽脑脊髓炎病毒.敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽脑脊髓炎病毒为100fg的RNA模板.该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽脑脊髓炎病毒的快速检测.     

鸭瘟病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

为建立一种简便、快速、灵敏度高、特异性好的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,根据GenBank中公布的DPV UL6基因组序列,设计了3对特异性引物,建立了LAMP快速检测方法。该方法的灵敏度可达0.1fg,对其他鸭常见病原体检测结果均为阴性,扩增反应只需在水浴锅中60min内即可完成,可通过肉眼观察颜色变化直接判定结果。结果表明,所建立的LAMP方法简便快捷,省时省力,是适用于现场和基层实验室快速、准确检测DPV的分子生物学方法。     

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。     

环介导等温扩增法(LAMP)在水生动物病害检测中的应用

近年来我国的水产养殖发展迅速,养殖面积和产量都位居世界第一。但是疾病频发一直是困扰水产养殖的一个问题,而病原的快速检测是水产动物疾病防控的前提和关键。随着水产病害基础研究的不断深入,病原的检测技术也得到快速发展。本文介绍了一种新型的核酸扩增技术——环介导等温扩增(l oop-medi at ed i sot hermalampl i f i cat i on,LAMP),综述了近年来LAMP方法在水生动物病害检测领域的具体应用实例和研究进展,并对该方法的应用前景做了展望。     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

研究针对布鲁杆菌保守的OMP25基因设计了4条LAMP的特异性引物,通过优化反应条件,建立了布鲁杆菌的LAMP快速检测方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测布鲁杆菌,其最低检测限为5 copies/μL.扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行判定.LAMP可以快速、直观、准确地检测布鲁杆菌,是一种适合基层现场应用的检测方法.     

环介导等温扩增技术快速检测猪细小病毒的试验

利用环介导等温核酸扩增技术(LAMP),建立了一种灵敏、特异、快速的猪细小病毒(PPV)检测方法.该方法针对猪细小病毒非结构蛋白(NS-1)基因保守区域设计6条特异引物,在63℃的等温条件下45 min即可完成反应.最低检测限量为10拷贝的PPV目的基因,比常规聚合酶链式反应(PCR)方法敏感100倍,并具有良好的特异性.以钙黄绿素和Mn2+作为荧光指示剂,可快速、直观判定反应结果.通过对149份临床样品进行检测比较,LAMP与PCR检出阳性样本数分别为33份和27份,表明LAMP方法阳性检出率高于PCR.     

基于单核细胞增生李斯特菌actA基因的环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

单核细胞增生李斯特菌(Lm)是主要的食源性致病菌之一,也是一种重要的人畜共患病原菌,感染人和动物后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多症等.为建立快速检测Lm的方法,本研究以Lm毒力因子actA作为特异性检测的靶基因,通过条件优化初步建立了快速检测食源性Lm的环介导等温扩增(LAMP)方法.并采用该方法进行了特异性、...     

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应.本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合.以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力.     

环介导等温扩增技术的改进及其在病原微生物检测中的应用研究进展

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出来的一种新型核酸扩增技术。自建立以来,该技术不断改进和发展,并广泛应用于病原微生物的检测,文章将就此展开综述。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

鉴别鸽新城疫病毒野毒株与疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法的建立

为建立一种能够区分鸽新城疫病毒(NDV)野毒株与常用新城疫疫苗株La Sota的重组酶介导的等温扩增方法(RAA),本研究针对基因Ⅵ型鸽源NDV和La Sota的NP基因设计出1对特异性引物,经过优化引物浓度、反应时间、反应温度,建立了能够区分鸽NDV野毒株与La Sota的RAA检测技术。对其特异性、敏感性和重复性进行测试,并应用建立的方法检测了45份临床样品。结果显示：该技术在15℃～39℃的恒温条件下,可于15 min内完成对目标基因的扩增;对禽支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和衣原体等常见病原的检测结果均为阴性;重组质粒标准品检测下限为39.5 copies/反应;45份临床病死鸽样品的检测,检出28份阳性,与常规PCR方法的检测结果一致。本研究结果说明建立的RAA方法可应用于临床样品的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

基于hipO基因的环介导等温核酸扩增技术检测食源性空肠弯曲菌

空肠弯曲杆菌是人细菌性胃肠炎的常见食源性致病菌之一,严重危害人类的健康,建立快速精准检测食源性空肠弯曲杆菌的方法,对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究建立了一种可视化、低成本基于hipO基因的环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测空肠弯曲菌的方法。该LAMP方法检测空肠弯曲菌CJFX01基因组DNA为阳性,而对肠出血性大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等食源性致病菌和胸膜肺炎放线杆菌Aha01、副猪嗜血杆菌Ahh01、多杀性巴氏杆菌Ahm03、猪链球菌Ahs02、猪丹毒丝菌Ahe01、支气管败血波氏杆菌Ahb01等猪源致病菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP检测空肠弯曲杆菌的检测限为5.4×10¹ CFU/mL,而基于F3/B3引物对常规PCR的检测限为5.4×10⁶ CFU/mL,即LAMP检测空肠弯曲杆菌的灵敏度比常规PCR高100 000倍。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、可视化、低成本、特异性好和灵敏度...     

环介导等温扩增技术（LAMP）在肉源性检测中的应用及前景展望

近年来,肉类掺假事件时有发生,给消费者和相关食品安全监督部门造成一定的困扰,同时威胁着消费者的身体健康。传统意义上的检测方法如酶联检测法及PCR法均存在一定的局限性,限制其在市场上进行快速的肉类鉴别。环介导等温扩增(LAMP)是一种新型核酸扩增技术,其灵敏度高、特异性强,不依赖专业仪器设备,操作简单,已开始被广泛应用于食源性微生物的检验。本文从LAMP原理出发,阐述了LAMP技术在肉源性检测中的应用,对LAMP技术的发展前景进行了展望。