大鲵虹彩病毒病灭活疫苗安全性与免疫效力研究

为了探明大鲵虹彩病毒病灭活疫苗的安全性与免疫效力,采用β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)内增殖的大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus,GSIV),制备成大鲵虹彩病毒病灭活疫苗,利用免疫...     

大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用

通过了解大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)在EPC细胞接毒情况和PCR的实际检测情况,为大鲵的病毒检测提供必要判断依据和检测方法.通过细胞接毒和组织分离分别提取病毒质粒,进行普通PCR扩增,电泳分析,比较病毒细胞培养和组织直接提取结果.Gsiv病毒体外培养:经传代48 h的EPC细胞,25℃培养,12h后可观察到CPE出现,24 h病变明显,CPE达15％,48 h后CPE可达70％,72 h后细胞完全脱落;PCR检测:对3个样本分别从组织提取和经细胞扩增分离的病毒进行普通PCR扩增检测,经细胞培养扩增的3个样本全部呈阳性;经组织提取的3个样本,2个呈阳性,一个呈阴性;电泳观察,病毒的扩增产物在500 bp左右.在体外环境下GSIV是高病力的一种病毒,对EPC细胞在25℃时效应时间为3d,普通PCR经组织的检出率低,经细胞培养扩增可提高检出率但耗时久,不利于实际生产中快速、准确诊断疫情的需要.     

大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究

对大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50)与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级,差异极显著(P<0.01);GSIV经有机溶剂氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,TCID50与对照组相比较分别下降了9.33、7.83、6.49个对数级,差异极显著(P<0.01)。冻融次数对GSIV滴度的影响不显著(P>0.05)。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明,GSIV可在鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)、斑点叉尾鮰肾脏细胞系(Channel catfish kidney,CCK)、虹鳟鱼性腺细胞系(Rainbow trout gonadal,RTG-2)等细胞中增殖,但在EPC、CCK细胞中增殖速度快,TCID50高;GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明,GSIV感染细胞6 h后TCID50开始快速上升,进入对数增长期,72 h时TCID50达到最大值,以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示,在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒,呈晶格状排列,直径约140 nm。     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因的克隆与原核表达

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,然后将其亚克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行Western blot分析。结果显示:PCR扩增出长度为1 392 bp的片段,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,SDSPAGE电泳显示该重组蛋白的相对分子质量约为67×103。免疫原性检测结果表明,该重组蛋白可与兔抗大鲵虹彩病毒阳性血清特异性反应,具有免疫原性。     

大鲵细胞与大鲵虹彩病毒的微载体规模化培养工艺及优化

利用Cytodex 3微载体悬浮培养系统规模化培养大鲵肌肉细胞(GSM)和大鲵虹彩病毒(GSIV),研究了微载体培养GSM细胞的形态和增殖特性,同时测定了病毒在培养系统中的增殖动态相关指标。结果显示,在Cytodex 3微载体培养系统中,将GSM细胞在贴壁期以转速30 r/min,每静置40 min搅拌2 min的方式间歇搅拌,10 h后贴壁率可达95%,培养基中最适血清浓度为10%,最适微载体浓度为2 g/L,最适细胞初始接种密度为1.2×10~5 cells/mL;增殖期以25 r/min的连续搅拌方式可以达到最佳的细胞生长效能。倒置显微镜与扫描电镜观察结果显示,GSM细胞呈长梭形,紧密贴附在Cytodex 3微载体上,生长良好。采用优化的工艺条件培养GSM细胞,以感染复数(MOI)为0.5的剂量接种GSIV至规模化培养的GSM细胞,48 h后GSM细胞出现典型的细胞病变效应,72 h病毒滴度达到最高TCID_(50)=10~(–8.50±0.20)/mL。本研究为大鲵虹彩病毒病疫苗的规模化生产工艺研究奠定了前期基础。     

i大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗研制成功

9月下旬,中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害研究室与鱼类养殖与育种研究室的科研人员在前期成功分离大鲵病毒性出血病病原——大鲵虹彩病毒的基础上,又成功研制出大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗。这项研究已经建立了细胞大规模培养、病毒大量增殖、病毒灭活的方法,灭活疫苗已经通过细菌检验、细胞培养安全性试验与鱼体安全性试验。疫苗的免疫保护效力试验正在进行中。     

“一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒及检测方法”获国家发明专利授权

<正>日前,由中国水产科学研究院长江水产研究所申请的"一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒及检测方法"获国家发明专利授权。发明人为曾令兵、孟彦、徐进、张辉、周勇、范玉顶。大鲵虹彩病毒(GSIV)是目前感染我国人工养殖大鲵的唯一病毒病原,其致死率高、传染性强,严重威胁着我国大鲵养殖业的健康可持续发展。     

一株大鲵虹彩病毒的分离及鉴定

2020年5月,广东广州某野生动物保护基地爆发疑似病毒引发的疾病。现场采样发现,病鲵体长约2 m,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究采用胖头鲤肌肉细胞系(fat head minnow epithelial cells, FHM)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大鲵中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大鲵虹彩病毒广州分离株(CGSIV-GZ)。FHM经患病大鲵组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的FHM细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,FHM细胞中存在大量直径约100～120 nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鲵组织样本进行PCR扩增,获得了431 bp的目的基因片段,测序后经采用BLAST软件分析,发现其与GenBank中的蛙病毒衣壳蛋白基因同源性达96%～99%。确认本次野生动物保护基地大鲵发生大规模死亡是蛙病毒感染所致。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。     

大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP 基因DNA 疫苗的构建及其免疫效果

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因序列设计特异性引物,经PCR扩增得到MCP基因编码框1392 bp全长序列,将其定向克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒并命名为pc DNA-MCP。将pc DNA-MCP质粒转染大鲵肌肉细胞系(GS-M),间接荧光免疫染色结果显示,MCP蛋白可在GS-M细胞中表达,且转染后72 h的表达量显著高于转染后48 h;收集转染后72 h的GS-M细胞,经Western blot检测,可检测到MCP蛋白的特异性表达。将真核表达质粒pc DNA-MCP以20μg/尾的剂量经背部肌肉注射免疫健康大鲵(Andrias davidianus),分别在免疫后第1、3、5、7、14、21、28、35天随机从实验组与对照组中采样,尾静脉采血进行外周血血细胞计数、白细胞分类计数及测定血清中和抗体效价。结果表明,免疫大鲵体内红细胞、中性粒细胞和单核细胞数量明显增加,红细胞数在第5天极显著高于对照组(P0.01);中性粒细胞(neutrophil)分类百分比从第3天开始升高,第5天达到峰值(26.33±1.04)%,极显著高于对照组(P0.01);单核细胞(monocyte)的变化趋势和中性粒细胞相似,第7天达到峰值(15.83±0.76)%,极显著高于对照组(P0.01)。随后淋巴细胞大量增殖,第28天淋巴细胞分类百分比达到峰值(68.33±1.53)%,极显著高于对照组(P0.01)。血清中和试验结果表明,免疫大鲵体内产生了抗MCP蛋白的抗体,免疫后第28天抗体效价最高[1︰(370.01±31.55)]。真核质粒pc DNA-MCP在免疫大鲵的肌肉、肝、脾和肾的组织表达检测结果显示,免疫接种后第1、3、5、7、14、21、28天大鲵的肌肉、肝、脾和肾组织中均存在真核质粒的分布;RT-PCR结果显示,免疫后第7天和28天,在大鲵的上述组织中均有目的基因的表达。攻毒感染试验结果显示,免疫组大鲵相对免疫保护率可达73.3%。本研究为真核表达质粒pc DNA-MCP作为潜在候选疫苗应用于大鲵虹彩病毒病的预防和控制奠定了前期基础。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR 检测方法的建立及应用

针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒.经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法.检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.9991,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107 copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号.取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104 copies/μL和3.02×102 copies/μL.本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义.     

鳜脑组织细胞系的建立及其病毒敏感性研究

鱼类细胞是开展鱼类病毒分离鉴定、功能基因分析以及生物制品制备等研究的重要物质基础。鳜(Siniperca chuatsi)是深受养殖者和消费者欢迎的养殖品种。随着鳜鱼养殖产量的逐年增加,其病害问题尤其是病毒病问题也日趋严重,但是,可用于鳜鱼病毒分离和基因功能分析的鳜细胞系缺乏。本研究采用组织块消化法,对来源鳜脑组织的细胞进行原代培养,建立了鳜脑组织细胞系,命名为MFB。MFB细胞在28℃含10%胎牛血清的L-15中已稳定传代超过70次,第25代鳜脑组织细胞的染色体众数为56。采用免疫荧光细胞化学技术(β-tubulin和Neu-N)鉴定MFB细胞的神经元纯度,结果显示,培养的MFB细胞为神经元类细胞。病毒敏感性实验结果显示,鳜蛙虹彩病毒(MFRaIV)、大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBRaIV)和大鲵虹彩病毒(GSIV)均可在MFB细胞中产生典型细胞病变效应,病毒滴度分别为108.68±0.12、108.36±0.15、1010.15±1.85 TCID50/mL。使用脂质体Lipofectamine®2000将pEGFP-N1转入MFB细胞,转染效率可达20%。本研究建立的鳜脑组织细胞系不仅对多种蛙虹彩病毒敏感,而且转染质粒效率较高,为鳜病毒性病原的分离及基因功能研究奠定了前期基础。     

传染性造血器官坏死病灭活疫苗的制备及免疫保护效果

为了研发用于预防传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)灭活疫苗,实验以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)在胖头鱥上皮细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)上对传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)进行连续传代培养,通过测定各代病毒滴度,结合病毒收获时间确定最佳增殖方案;采用不同浓度的β-丙内酯(β-propanolactone,BPL)在24℃下灭活,经安全性实验验证后确定最佳灭活条件。以不同剂量腹腔注射免疫虹鳟,以磷酸盐缓冲溶液(PBS)为阴性对照组,通过检测攻毒后相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)、免疫相关因子表达量及血清中和抗体效价来分析该疫苗的保护效果。结果显示,最佳增殖方案为以MOI为0.000 1接种,15℃培养3 d;最佳灭活条件为以终浓度3.0 mmol/L的BPL将IHNV在24℃下灭活24 h;以最佳免疫剂量10μL/尾腹腔注射免疫虹鳟,免疫后7、21、45和60 d的相对免疫保护率分别为91.37%、84.28%、84.15%和47.5%,免疫后60 d时RPS显著低于其他时间点免疫组;免疫相关基因的实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR,RT-qPCR)结果显示,与阴性对照组相比,Mx-1和IFN-γ表达量在免疫后7、15和30 d脾脏和头肾中均显著上调,在第7天时达到最大值(5倍);CD4和IgM表达量在免疫后15 d脾脏和头肾中均显著上调;在免疫后第30、45和60天虹鳟血清IHNV中和抗体效价依次为67.25、43.40和29.78,呈下降趋势且各组间差异显著。研究表明,该灭活疫苗可诱导虹鳟产生特异性免疫和非特异性免疫反应,对虹鳟具有显著的免疫保护作用。本研究为IHNV灭活疫苗研发提供参考。     

重组酶快速检测十足目虹彩病毒1方法的建立

为建立十足目虹彩病毒1的快速检测方法,根据十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(ORF114R)保守序列设计特异性引物,通过条件优化,建立基于重组酶聚合酶扩增技术的十足目虹彩病毒1检测方法.重组酶聚合酶扩增技术的最优扩增温度为30℃,恒温反应20 min内即可完成.特异性试验结果显示,该方法与其他常见虾类感染病毒无交叉反应....     

大口黑鲈肝脾肿大病病原研究

为了查明2009年10月广东省佛山地区养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)中暴发的传染性疾病的病原,对病鱼的肝脏、脾脏和腹隔膜进行切片电镜观察,发现细胞质中有大量病毒颗粒,切面为六角形,直径约145～150 nm,病毒为二十面体对称结构、无囊膜、似虹彩病毒的病毒粒子.用除菌的病鱼组织滤液感染健康大口黑鲈,被感染鱼死亡率达90%以上.根据已知虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计特异引物,提取人工感染发病鱼的肝脏、脾脏、肾脏组织的DNA进行PCR扩增,将扩增片段进行序列测定与分析,结果表明该序列与已报道的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)MCP基因同源性为98%.电镜观察和MCP基因测序分析结果显示,该病毒的分类地位为虹彩病毒科(Iridoviridae)细胞肿大病毒属(Megalocytivirus).     

一株似鲇高原鳅源蛙病毒的分离与鉴定

从四川乐山某养殖场自然发病的似鲇高原鳅(Triplophysa siluroides)体内分离到一株病毒FYL140220。病毒感染鲤上皮瘤细胞系(epithelima popuasum cuprini,EPC)后,细胞呈现圆缩、坏死、脱落、明显空斑的病变特征。将自然发病鱼组织过滤除菌液和细胞培养病毒液分别接种健康似鲇高原鳅,试验鱼出现与自然发病鱼相同的症状,死亡率分别为30%和40%,而对照组无异常。对经FYL140220感染出现典型细胞病变(CPE)的EPC细胞制备超薄切片进行电镜观察,发现病毒呈正六边形,对称20面体,对角线直径约(103±7)nm;提取细胞培养病毒液、自然发病鱼和人工感染发病鱼的内脏器官总DNA进行蛙病毒主要衣壳蛋白(maior capsid protein,MCP)基因保守区域的PCR扩增,均能扩增出预期大小约500 bp的特异性条带。MCP基因同源性与遗传进化分析表明,分离株FYL140220与蛙病毒属成员聚为一支,尤其与大鲵蛙病毒与沼泽绿蛙病毒同源性最高,分别达99.8%和99.6%。结合PCR检测、电镜观察和系统发育分析,确认分离病毒FYL140220为蛙病毒,这是首次报道蛙病毒可自然感染似鲇高原鳅并致死。     

山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析

2008年11月～2010年11月,采集山东海域大菱鲆、石鲽、鲈鱼各20批,按照世界动物卫生组织推荐的PCR检测方法对真鲷虹彩病毒病(Red Sea Bream Iridoviral Disease,RSIVD)进行初步调查.结果显示,共检出4例RSIVD感染样品.以真鲷虹彩病毒(Red Sea Bream Iridovirus,RSIV)和传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)主要衣壳蛋白基因为基础,设计简并引物,PCR扩增本次检出阳性样品的RSIV/ISKNV MCP基因.将MCP基因PCR扩增产物测序,提交GenBank,并以MCP基因为基础,对被检出的阳性样品进行虹彩病毒属系统分类,绘制进化树.由进化树得出,4例阳性病毒株均属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属.     

一株大黄鱼虹彩病毒的分离鉴定及多克隆抗体的制备

2021年7月,浙江省象山某养殖场养殖的大黄鱼（Larimichthys crocea）出现类似大黄鱼虹彩病毒引起的疾病。采用鲤上皮瘤细胞培养和病毒主要衣壳蛋白测序分析的方法,从患病的大黄鱼中分离到一株病毒。该病毒接种到鲤上皮瘤细胞（EPC）后出现空斑、脱落的细胞病变症状。根据虹彩病毒MCP和ATPase基因保守序列设计特异性引物对病毒组织样本进行PCR扩增,得到分别为1 367 bp和740 bp的目的基因片段。将MCP基因扩增片段测序,经BLAST对比及系统发育树聚类分析,确定该分离的病毒属虹彩病毒科细胞肿大病毒属。通过蔗糖密度梯度离心纯化,用透射电镜观察该病毒粒子呈正六边形,直径为120～150 nm。用纯化病毒作为抗原免疫小鼠获得抗大黄鱼虹彩病毒的多克隆抗体,效价为1∶7 000;通过SDS-PAGE和Western blotting初步确定3个免疫蛋白。本研究为大黄鱼虹彩病毒纯化提供一种新方法,并初步分离出免疫蛋白,为该病毒相关分子生物学研究、蛋白研究以及疫苗制备等提供理论依据。     

一株湖北源大口黑鲈蛙病毒的分离鉴定

采用电子显微镜观察和细胞培养等技术, 从湖北黄陂某养殖场患病大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内发现并分离到一株蛙病毒。患病大口黑鲈的临床症状主要表现为体表出血、溃疡, 肝脏发白。将病鱼内脏组织匀浆超微滤液接种鳜脑细胞系(mandarin fish brain, MFB)细胞能产生典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 病毒滴度达到 10^8.36±0.15 TCID₅₀/mL。细胞培养病毒的超薄切片电镜观察结果显示, 细胞质中存在大量直径约为 150 nm 左右的正六边形病毒粒子, 呈晶格排列。细胞培养病毒的人工感染大口黑鲈试验结果显示, 7 d 内试验鱼死亡率高达 100%, 其临床症状与自然发病鱼相似。采用大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)的特异性 PCR 检测方法对患病鲈组织样品和细胞培养病毒样品进行检测, 均能扩增出 241 bp 的单一目的条带。进一步根据 GenBank 中 LMBV 主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物, 均能从上述样品中扩增出 1392 bp 的 MCP 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长。将 MCP 氨基酸全序列进行比对, 结果显示其与 Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型及大口黑鲈溃疡综合征病毒的 MCP 氨基酸序列同源性高达 100%。系统进化结果显示, 与感染鱼类的虹彩病毒科蛙病毒属病毒, 如鳜鱼蛙病毒、Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型和大口黑鲈溃疡综合征病毒等聚成一支。这些结果证明, 该分离株为虹彩病毒科蛙病毒属的成员, 暂命名为大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus, LMBRaV)湖北株 LMBRaV-HB001。病毒敏感细胞系筛选试验结果表明, 病毒 LMBRaV-HB001 感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼性腺细胞(grass carp ovary, GCO)、大鲵肌肉细胞(giant salamander muscle, GSM)和鲫脑组织细胞(gibel carp brain, GiCB)均能产生典型 CPE, 病毒滴度可达 10^8.0 TCID₅₀/mL 以上。本研究首次在湖北省养殖大口黑鲈体内分离与鉴定了 LMBRaV 病毒, 建立了病毒的细胞培养方法, 为进一步研究该病毒的传播、诊断和防控技术提供了重要参考。