过表达冷诱导RNA结合蛋白对BHK-21细胞增殖的影响

用常规细胞培养法连续传代培养Cirp过表达BHK-21细胞至第8代标记为BHK-21-Cirp△,通过HE染色和扫描电镜对细胞形态观察,用BHK-21-Cirp△和BHK-21-ShCirp分别与BHK-21-GFP进行细胞增殖速度的比较,并绘制96 h增殖曲线计算比生长速率,用流式细胞仪检测各试验细胞周期.HE染色和...     

17-β-雌二醇对小鼠胸腺上皮细胞增殖的影响

为探讨17-β-雌二醇对小鼠胸腺上皮细胞增殖的影响及其分子机制,将小鼠胸腺上皮细胞系(MTEC1)经不同浓度和不同时间的17-β-雌二醇处理后,采用CCK-8法、Edu掺入法检测细胞增殖活性的变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;DAPI染色法检测细胞核形态的变化;Western blot技术检测细胞周期相关基因CDK1及CyclinB1蛋白表达的变化。结果显示,雌激素显著抑制MTEC1细胞的生长,并呈时间和剂量依赖性;雌激素处理组G2/M期细胞显著增多,出现G2/M期阻滞;细胞形态变化明显,出现形状变大、多核、核染色质凝聚等现象;CDK1及CyclinB1的蛋白表达水平显著下调。结果表明,17-β雌二醇可以抑制MTEC1细胞的增殖,其机制可能是通过下调细胞周期正调节因子CDK1及CyclinB1的表达,使细胞阻滞于G2/M期。     

藏野驴皮肤成纤维细胞分离培养及生物学特性分析

为了研究藏野驴成纤维细胞分离培养方法及生物学特性,以7岁龄藏野驴耳部皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行细胞原代培养,采用胰酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,通过细胞形态观察、生长曲线测定、细胞周期和免疫荧光染色对细胞进行鉴定。结果显示,成纤维细胞生长曲线呈“S”形,细胞生长状态良好,细胞特异性标记免疫荧光染色显示FSP-1呈阳性表达。结果表明,成功建立了藏野驴成体耳部皮肤成纤维细胞体外分离、培养和鉴定方法,为藏野驴种质资源保护、细胞水平及分子水平的研究奠定了基础。     

BrdU标记内蒙古绒山羊皮肤干细胞的初步研究

为了探讨BrdU 标记绒山羊皮肤干细胞的可行性,并初步确定干细胞的位置,试验采用静脉注射BrdU后进行免疫组化检测,分离培养毛囊的标记部分并检测细胞周期.结果表明:BrdU在绒山羊体内的标记时间为10周;免疫组化AEC染色阳性细胞核呈红色,阴性细胞核不被着色,说明BrdU标记信号存在于初级、次级毛囊及表皮中;注射初期毛囊及表皮增殖细胞均被标记(包括干细胞),4周时标记细胞主要位于毛囊的下部,6周时阳性信号减少且有向上迁移迹象,8～10周标记细胞明显减少或消失,10周后无阳性信号;Ⅳ型胶原黏附培养毛囊的标记部分细胞呈克隆生长;流式细胞检测得到F2代G0/G1比为(73.98±4.74)%,初步证明干细胞的存在.     

新疆驴成纤维细胞原代培养及鉴定

为了获得纯度较高的驴皮成纤维细胞并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采用组织块贴壁法进行原代细胞培养,用胰蛋白酶联合组织块进行差时消化法分离、纯化成纤维细胞,并通过细胞形态观察、PCR扩增鉴定vimentin、免疫荧光染色法鉴定分离的细胞并计算纯度,用CCK-8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存前后的细胞活率。结果表明：分离纯化后的细胞呈梭形或纺锤形,具备典型的成纤维细胞形态;PCR扩增可清晰检测到vimentin的表达条带;细胞免疫荧光显示vimentin染色为阳性,DAPI核染呈椭圆形,以上方法均鉴定为成纤维细胞;体外培养的驴皮第3代成纤维细胞48 h后进入对数生长期,其生长曲线呈“S”型;冻存前和复苏后细胞活率差异不显著(P>0.05)。说明经体外分离、纯化成功获得了驴皮成纤维细胞。     

一种同时进行牛囊胚差异染色和凋亡染色的方法

旨在优化双重荧光染色方法的基础上,建立囊胚的三重免疫荧光染色方法,以期更经济、高效、准确地评估胚胎质量。三重免疫荧光染色方法分别用CDX2蛋白、caspase-3蛋白和Hochest 33342标记囊胚的滋养层细胞、凋亡细胞和所有细胞的细胞核,共3种染色方案。双重荧光染色方法采用PI染色滋养层细胞,或通过TUNEL法进行凋亡细胞染色;而囊胚细胞的细胞核用Hochest33342染色。结果表明,三重免疫荧光染色方法获得的图像清晰,能准确地标记囊胚中的各类细胞。另外,比较3种染色方案的准确性、复杂性及染色效果,确定两种一抗或两种二抗共同孵育的方案准确度高、效果好、且用时最短,为最佳染色方案。综上表明,在同一枚囊胚中,通过标记CDX2和caspase-3蛋白来鉴定其滋养层细胞和凋亡细胞,并进行囊胚质量的评估是可行的,而且较双重荧光染色有较大的优势。     

鲤鱼肌肉卫星细胞的体内标记方法

为了研究鲤鱼肌肉卫星细胞的体内标记方法,试验以幼鱼及一年生鲤鱼为材料,在常温下饲养,试验时采用不同给药方式将胸腺嘧啶类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)对鱼进行活体标记后,取不同部位的鱼肌肉组织制成冰冻切片,再进行免疫荧光染色,最终统计比较肌肉卫星细胞的数量指数。结果表明:采用肌肉注射法对鲤鱼肌肉卫星细胞标记效果较好。     

不同荧光染料对苜蓿原生质体染色效果的研究

以紫花苜蓿品种甘农4号(Madicago sativa L.‘Gannong No. 4’)愈伤组织酶解的原生质体为材料,采用FDA、罗丹明B、罗丹明6G、吖啶橙和DAPI共5种荧光染料对原生质体进行染色效果比较,以期为原生质体活力测定、细胞核计数及原生质体融合过程的观察提供参考。结果表明:FDA、罗丹明B、罗丹明6G和吖啶橙均可使紫花苜蓿原生质体清晰染色,可用于细胞融合时亲本原生质体的标识。FDA是检测原生质体活力的理想染料;吖啶橙和DAPI可对细胞核进行特异性染色,可用于融合时细胞核的观察和计数,前者还可用于检测融合细胞的活力。通过对异源融合体的鉴别及其活力的测定,为摸索融合条件和融合细胞的培养提供了理论依据。     

用原位杂交对BHK-21细胞中的FMDV定位和检测

为了明确FMDV在细胞内的增殖部位，建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法，对试验接种FMDVO／Akesu／58（10^7TCID50）毒株的BHK-21细胞中2～10h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位。选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针，采用尾段标记法以地高辛-11-d UTP标记，用原位杂交敏感加强型试剂盒检测杂交体。结果显示，从感染FMDV后2～10h内的BHK-21细胞中检测出阳性染色的病毒粒子，这些病毒粒子大多集中在核周围，随感染时间延长阳性染色信号增强。这说明用寡核苷酸探针与敏感加强型试剂盒结合对检测细胞内低拷贝的病毒粒子是可行的，同时也从分子水平上证明FMDV主要在细胞质中进行复制和繁殖。     

培养法和染色法对养殖环境中微生物气溶胶浓度的检测

比较不同检测方法对微生物气溶胶检验效果的影响。采用国际标准的AGI-30空气采样器,收集空气样品,分别用培养计数法和DAPI(4,6-联脒-2-苯基吲哚)染色计数法来比较不同养殖环境中微生物气溶胶的浓度。培养计数法测得鸡舍、猪舍和牛舍环境中微生物气溶胶的浓度分别为5.73×105～6.72×106cfu/m3空气,9.5×105～4.01×106cfu/m3空气,5.4×104～8.33×105cfu/m3空气,而DAPI染色计数的浓度分别为8.0×106～3.25×108cell/m3空气,1.5×107～2.28×108cell/m3空气,9.0×105～5.93×107cell/m3空气。培养计数法所得浓度仅为DAPI染色计数法的0.04%～10.4%。染色计数法可能会更加客观的反映环境中微生物气溶胶的浓度。     

家蚕中肠上皮细胞增殖和分化的初步研究

通过分析家蚕自幼虫期到蛹期发育过程中肠上皮细胞的增殖与分化情况,鉴定家蚕中肠干细胞的潜在定位。采用苏木精和伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色追踪变态和发育时期家蚕中肠的形态结构及细胞组成变化,结果显示,幼虫经历蜕皮及变态时,中肠形态结构以及中肠上皮细胞组成均发生明显变化:在幼虫每个龄期的盛食期肠壁较薄,眠前期(蜕皮前)明显变厚,至眠期其厚度达到峰值;中肠上皮层存在柱状细胞(CC)、杯状细胞(GC)和再生细胞(RC)3种细胞,3种类型细胞随龄期逐渐增多,其中各龄期柱状细胞持续增多,至眠期达到峰值,靠近基底膜的小细胞在眠前期增多。利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)和磷酸化组蛋白(Phospho-histone H3,PHH3)免疫荧光染色检测到中肠上皮细胞,尤其是中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞在幼虫各龄眠前期的增殖率最高。同时通过BrdU滞留标记实验在中肠上皮层靠近基底膜处发现了BrdU滞留阳性信号。研究结果发现家蚕幼虫蜕皮时中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞发生快速增殖,推测这些小细胞中存在着潜在的家蚕中肠干细胞。     

TLN-58和hLYZ基因融合表达载体的构建及其细胞毒性研究

为了评价融合表达抗菌肽TLN-58和人溶菌酶hLYZ双基因重组表达质粒的安全性,试验采用基因重组法将TLN-58和hLYZ基因片段克隆至pEGFP-N1载体,利用转染试剂GeneTwinTW将构建好的重组质粒转染HEK293细胞,RT-PCR验证重组真核质粒在细胞中表达情况;通过DAPI染色、AO/EB染色、CCK-8...     

新生奶牛成骨细胞的体外培养、鉴定及生物特性

取新生奶牛肋骨,剪成1 mm3大小骨片,胰蛋白酶消化5次,D-Hank's液彻底冲洗后,骨片置于含15?S的DMEM中培养,获取单层细胞.采用倒置显微镜下观察细胞形态,改良钙-钴法染色,检测碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)mRNA丰度及骨钙素蛋白浓度等方法,对细胞进行鉴定.通过MTT法绘制生长曲线,研究细胞增殖特性,茜素红染色观察细胞钙化功能.结果显示,采用本法所获得的细胞具有典型的成骨细胞形态和特性:ALP染色呈阳性,活性水平较高;培养7 d后可检测到骨钙素mRNA表达,12 d后细胞上清液中可检测到骨钙素蛋白;诱导培养2周后细胞可形成钙化结节.提示采用胰蛋白酶消化,组织块移行法所培养的细胞具有成骨细胞特性.本方法可获得高纯度、高活性的奶牛成骨细胞.     

绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性

为研究绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性,取30日龄的绵羊胚胎,采用联合酶消化法及差速贴壁法分离培养获得均质的肌源性干细胞,并对其进行一系列生物学特性检测。结果显示,绵羊肌源性干细胞能传代培养至35代以上;免疫荧光染色和RT-PCR鉴定肌源性干细胞表面标记物Sca-1、CD34、CD144和Desmin呈阳性表达;生长曲线和细胞周期结果显示绵羊肌源性干细胞具有较强自我更新能力;通过不同的诱导方法可以将肌源性干细胞成功地诱导为肝样细胞和胰岛样细胞,Schiff染色和双硫腙染色均呈阳性,RT-PCR检测肝样细胞特异性标记物AFP和ALB以及胰岛样细胞特异性标记物Insulin均呈阳性表达,进一步证明了其诱导分化潜能。结果表明,本试验成功地分离培养获得了均质并具有较强自我更新潜能的绵羊肌源性干细胞,这种干细胞具有向肝样细胞和胰岛样细胞分化的潜能,这为临床治疗提供了潜在的理论基础和大量的种子细胞。     

伏马毒素B_1对人脐静脉血管内皮细胞的毒性作用研究

为探究伏马毒素B_1(FB_1)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的毒性及作用机制,采用不同质量浓度的FB_1处理HUVEC,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,荧光显微镜观察细胞氧化应激,流式细胞术检测线粒体膜电位变化,Hoechst33342染色检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的转录情况。结果显示:FB_1处理组在低质量浓度(2.5、5μg·mL~(-1))短时间(6、12h)处理后细胞活力变化不显著,超过此剂量和时间细胞活力显著降低(P0.05或P0.01),且质量浓度为10、20μg·mL~(-1) FB_1处理组活性氧(ROS)的荧光信号增强;FB_1处理组细胞周期由G_0/G_1期向S期转换时阻滞,细胞线粒体膜电位降低,细胞凋亡相关基因Caspase-3转录升高,Bcl-2转录显著降低(P0.05),Caspase-9和Bax转录极显著升高(P0.01)。结果表明,FB_1对人脐静脉血管内皮细胞有毒性作用,能抑制细胞增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1期;能通过线粒体途径诱导HUVEC凋亡。研究结果为深入研究FB_1对人类细胞的毒性作用机制及相关疾病治疗奠定基础。     

家蚕五龄至预蛹期翅原基及造血器官的切片观察

通过家蚕翅原基石蜡组织切片H.E染色和DAPI荧光染色的方法对五龄至预蛹期家蚕翅原基及造血器官的形态结构进行显微观察。实验发现:翅原基在预蛹前变化不大,而到预蛹期发育加快。翅芽细胞在5龄初到蛹前一直保持着器官芽状态,细胞密集,核物质丰富,占细胞比例大。造血干细胞的细胞核较大,在化蛹前进行大量增殖,随造血器官的破裂造血干细胞并散落到体腔中。     

环境激素阿特拉津对家蚕卵巢培养细胞(BmN)凋亡的影响

为探讨利用鳞翅目昆虫对环境激素进行生物学评价和监测的方法,用2,3-二苯基溴化四唑(MTT)、4’,6二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色和单细胞凝胶电泳(SCGE)、流色细胞仪检测(FCM)等技术,分析检测了环境激素阿特拉津(AT)对体外培养家蚕卵巢细胞(BmN)细胞增殖和凋亡的影响。结果显示：AT浓度超过0．0625mmol/L,显著抑制了BmN培养细胞48h的存活率(p＜0．001),LC_(50)为0．0703mmol/L;0．0625～0．5000mmol/L AT处理24h后,BmN细胞核出现明显的凋亡现象;0．5000mmol/L的AT处理48h后,BmN细胞DNA链发生断裂。AT对BmN细胞增殖和凋亡的影响有明显的时间-剂量效应。长期处于AT污染的环境中对鳞翅目昆虫可能有严重的细胞毒性。     

猪肌肉卫星细胞的分离培养及生物学特性鉴定

以猪胎儿为材料,采用胶原酶消化法或组织块法培养胎儿背部最长肌获得了肌肉卫星细胞,该细胞体外可以传到9代以上。培养的细胞多呈纺锤体型和梭型,具有明显的方向性,呈典型的长轴平行排列。流式细胞仪分析结果显示,该细胞呈CD29、CD166、CD45、CD44阳性,CD71、CD34阴性。RT-PCR检测发现其表达Desmin、C-Myc、Nanog、Pcna、Oct4、Klf4,弱表达Myog,不表达Sox2、MyoD。免疫组化染色发现其表达Desmin等肌肉细胞的特异性标记,同时表达Nanog、Pcna等多能性细胞标记。本试验建立了一种简便高效的猪肌肉卫星细胞体外分离和培养方法,得到的细胞具有肌肉卫星细胞的典型生物学特性,同时表达间质干细胞和多能性干细胞的部分标记。     

Hela细胞裸鼠模型中肾脏VEGF的表达

目的:通过建立免疫功能缺陷裸鼠异种移植Hela细胞动物模型,检测免疫功能缺陷裸鼠肾脏中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,研究Hela细胞的转移。方法:建立Hela细胞注射裸鼠模型,成瘤后收集并固定瘤体及肾脏组织,对肾脏组织进行石蜡包埋,染色方法使用苏木精-伊红染色法(HE染色法)以及免疫组织化学染色法(SP法),通过HE染色检测组织完整性,免疫组化染色检测VEGF表达水平。结果:实验结果表明免疫功能缺陷裸鼠异种移植Hela细胞动物模型肾脏的肾小管上皮细胞中VEGF高度表达,且通过染色及显微镜观察发现肾脏中出现淀粉样变及肾小管自溶现象。结论:VEGF蛋白在Hela细胞裸鼠模型肾脏中肾小管高表达,说明该蛋白于此接种模型的成瘤过程中发挥着一定的生物学作用。     

山羊睾丸生精细胞体外培养和鉴定

试验采用两步酶消化法对2月龄公羔睾丸进行处理,得到了总数为7.44×109的生精细胞悬液,经台盼蓝染色,细胞活率在90％以上;支持细胞的贴壁性极好,生精细胞附着在支持细胞上,随着培养时间延长,生精细胞、支持细胞逐渐退化,呈现“集合”的趋势,细胞数量逐渐减少;经BrdU标记、H.E.染色,检测培养的生精细胞到分化到圆形精子细胞阶段,表明成功构建了山羊睾丸生精细胞共培养体系,可为后续深入研究山羊精子体外成熟培养提供一定的实验依据.