LAMP技术的染料、辅助剂的研究进展

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是广泛应用于病原物检测的核酸扩增技术,主要通过反应前后染料的颜色变化来判断检测结果,具有特异性强、操作简单和高效快捷等优点。LAMP技术所用染料、辅助剂的种类多样,适用条件和用量各不相同,若不合理使用则会抑制酶活性或造成假阳性。本文重点分析了不同染料、辅助剂对LAMP试验结果的影响,并总结了试验过程中假阳性的预防措施。     

环介导等温扩增终端产物检测及结果判断的研究进展

摘要：环介导等温扩增（LAMP）技术在2000年被日本学者Notomi 等提出,并用琼脂糖凝胶电泳及SYBR GreenⅠ荧光定量的方法对其产物、扩增灵敏度进行了分析。为了使LAMP终产物检测更加简单、直观、省时,国内外科学家进行了大量的研究,先后提出浊度分析法、HNB指示剂、蜡丸染料等简便易操作的LAMP终产物检测及结果判断方法,目前应用较多的是琼脂糖凝胶电泳、浊度分析法、HNB指示剂法与SYBR GreenⅠ指示剂法。本文就近年来LAMP终产物检测及结果判断进行了综述,汇总了近年来LAMP终产物检测方法,以期为未来LAMP终产物检测方法的发展提供新的思路。     

利用环介导等温扩增技术检测黑白轮枝菌

[目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。[方法]基于LAMP技术,通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异,选取Tub(β-tublin,编码β-微管蛋白)基因作为靶标基因,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物,在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系,并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。[结果]特异性试验中,仅黑白轮枝菌菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为1 pg·μL~(-1)。Tub-LAMP技术能够检测出发病苜蓿植物组织中的目标菌,在采自新疆的7份疑似样本中检测到3份阳性。在土壤中人工添加孢子的试验中,Tub-LAMP技术能够从每0.25 g土壤含有10个孢子和每10 g苜蓿种子含有50个孢子中检测出该病菌。[结论]该方法的建立为黑白轮枝菌的检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。     

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。     

环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌

建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。     

环介导等温扩增技术在食源性沙门氏菌检测中的应用研究进展

沙门氏菌是世界上最常见的食源性致病菌之一,全球每年沙门氏菌中毒事件居细菌性中毒事件首位。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型的核酸恒温扩增方法。2005年首次报道了采用LAMP技术快速检测沙门氏菌的研究,在随后的十几年中,LAMP技术不断优化完善,并广泛应用于食品沙门氏菌的现场检测。本综述阐述LAMP的技术原理和特点,归纳基于LAMP技术的不同平台在沙门氏菌快速检测中的应用,同时对LAMP技术假阳性率高的问题进行了探讨,并对LAMP技术的发展方向和研究趋势提出了几个设想。     

对虾桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速检测方法的建立

根据对虾桃拉综合征病毒（TSV）结构蛋白基因保守序列,利用Primer Explorer 40软件设计了4条引物,建立桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速（RT LAMP）检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化;同时将建立的RT LAMP检测方法与RT PCR进行比较分析,RT LAMP的检测灵敏度比RT PCR高10倍。结果表明,RT LAMP最适反应在60 ℃恒温条件60 min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果;RT LAMP对感染TSV的对虾检测呈阳性,而对对虾其他常见病原检测均为阴性,具有高的特异性。     

环介导恒温扩增技术及其在昆虫学领域的应用前景

环介导恒温扩增技术是一种新颖的核酸扩增技术。本文介绍了环介导恒温扩增(LAMP)技术的原理、引物设计、扩增机制、产物检测等方面的内容,归纳了LAMP技术与常规PCR方法的优缺点;并对LAMP技术在病毒、细菌、寄生虫检测中的应用现状进行了阐述,展望了LAMP技术在昆虫检测鉴定领域的应用前景。     

环介导等温扩增技术的改良及其在检测中的应用进展

环介导等温扩增(LAMP)技术是一种具有特异性强、灵敏度高、快速简便、扩增高效等优点的等温核酸扩增方法。近年来,该技术在许多方面得到了进一步的改进和发展,主要体现在多重LAMP技术的实现以及LAMP技术与其他技术的联合应用方面。对LAMP技术在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中的应用进展进行了综述,并对LAMP技术的应用前景进行了展望,为今后LAMP技术的发展及应用提供参考。     

食品中金黄色葡萄球菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌,主要经食品传播,引起食物中毒、组织及器官的化脓性炎症,建立快速、准确的检测方法对预防和控制金黄色葡萄球菌的传染具有重要意义。【方法】DNA环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新颖的快速、高灵敏核酸扩增技术,本研究利用该技术建立金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。基于金黄色葡萄球菌高度保守的Sa442基因序列,设计4条特异性LAMP扩增引物,两条外引物F3和B3及两条内引物FIP和BIP,在BstDNAPolymerase作用下,65℃恒温水浴中,对26个种类共45株细菌进行扩增,所试的20株金黄色葡萄球菌均为LAMP阳性,说明所设计的LAMP引物具有高度特异性。【结果】本LAMP方法对纯培养的金黄色葡萄球菌检测灵敏度为25CFU/mL,对污染食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为42CFU/g,40—60min内即可完成检测。检验检疫实践证明,利用本LAMP方法对958份肉类、蛋奶及其制品、人工污染样品等进行检测,检出115份LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。【结论】本LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

基于环介导等温扩增技术快速检测瓜果腐霉菌

[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码Trypsin蛋白酶的基因是瓜果腐霉菌特异的基因,以该序列作为靶标建立了LAMP检测方法。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为指示剂,在等温条件(64℃)下进行核酸扩增反应60 min,即可通过肉眼直接观察结果,HNB显示天蓝色即为阳性反应;同时,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性试验中,建立的LAMP检测方法能将瓜果腐霉菌和其他病原菌区分开。灵敏度试验中,LAMP检测方法的最低检测限为100 pg·μL-1,与Real-time PCR反应灵敏度一样,是普通PCR反应灵敏度的100倍。发病组织实际检测试验中,该LAMP方法能检测出人工接种发病植株中的瓜果腐霉菌。[结论]成功建立了一种适用于基层使用的针对瓜果腐霉菌的快速检测技术,为该菌所致病害的准确诊断奠定了技术基础。     

乙型脑炎病毒可视化快速检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了简便、可靠的快速检测乙型脑炎病毒JEV(Japanese encephalitis virus)的可视化方法。根据Gen Bank数据库中JEV Henan-09-03毒株(Gen Bank ID:GQ336809.1) E蛋白序列,设计了3对特异性LAMP引物,建立Bst DNA Polymerase等温扩增体系,优化后的反应体系可高灵敏性、特异性检测JEV。本方法通过在扩增产物中加入SYBR Green I染料后用石蜡进行封闭,在可见光下根据反应液荧光的颜色深浅来判断JEV扩增阳性强弱。结果显示,该方法的灵敏度可达5copies·m L-1,且与其他病毒,如乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B virus,HBV)无交叉反应。     

LAMP检测沙门氏菌方法的建立

环介导等温扩增(LAMP)是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。研究选取沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因设计了1套引物,总反应体系25μL,63℃恒温1 h,用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性,而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性;LAMP的灵敏度为6.8×101cfu/mL。LAMP检测方法更快速、灵敏,有着较为广泛的发展前景。     

LAMP检测沙门氏菌方法的建立

环介导等温扩增(LAMP)是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。研究选取沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因设计了1套引物,总反应体系25μL,63℃恒温1 h,用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性,而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性;LAMP的灵敏度为6.8×101cfu/mL。LAMP检测方法更快速、灵敏,有着较为广泛的发展前景。     

环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

研究了用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌的方法。首先根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc中的保守序列设计特异性引物,建立并优化反应条件,然后通过对金黄色葡萄球菌及其他菌种的对比试验,验证引物的特异性并确定方法的检测限。结果表明:在用加环引物的条件下,LAMP反应体系于60℃反应35 min即可扩增成功,而用未加环的引物则需45 min才能看到白色絮状沉淀。对2株金黄色葡萄球菌、3株大肠杆菌、1株醋酸杆菌、1株沙门氏菌进行同步检测,结果发现2株金黄色葡萄球菌均显示阳性,而其他菌株均显示阴性。研究确定了LAMP检测纯培养的金黄色葡萄球菌的最低检测限为100 fg,比PCR的最低检测限低2个数量级。由研究结果可以看出,LAMP法检测金黄色葡萄球菌操作简便,有较高的特异性、灵敏度,为快速检测食品中的致病菌提供了较好的技术平台。     

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断.     

LAMP技术诊断猪支原体肺炎的应用研究

应用环介导等温扩增技术(LAMP)对猪支原体肺炎进行诊断应用研究,对来自黑龙江不同地区的患猪呼吸道疾病的肺脏病料64份进行检测,54份诊断为阳性,阳性率84.3%。健康猪鼻拭子共176份,经LAMP检测,157份为阳性,阳性率为89.2%。其中健康猪拭子带菌率较高,结果表明,LAMP技术可应用于猪支原体肺炎的临床诊断。     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立和初步应用

根据GenBank上已报道的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组序列设计1组LAMP引物(F3/B3、FIP/BIP),通过对环介导等温扩增技术(LAMP)反应条件的优化,建立了猪圆环病毒2型LAMP检测方法,并对阳性结果进行了酶切验证。结果表明:该方法具有较高的检测灵敏度,最低可以检测到反应体系内1 pg的PCV2DNA;通过反应结束后的肉眼可视化观察,可方便地进行结果判定。本研究建立的PCV2 LAMP检测方法能够满足基层临床PCV2病原的快速检测要求。     

基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究

【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒（IBV）环介导等温扩增（LAMP）检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温（63 ℃）条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。     

环介导等温扩增技术检测沙门氏菌反应体系的优化

[目的]建立快速检测沙门氏菌的环介导等温扩增（LAMP）技术。[方法]以沙门氏菌的特异性基因（invA）序列为靶序列设计引物,并对该序列进行等温扩增;对Mg2＋浓度、反应温度和反应时间扩增条件进行优化,并对沙门氏菌进行检测和鉴定。[结果]在Mg2＋浓度为2.0mmol/L时,62℃反应40min,扩增可达最佳效果,LAMP法检测的灵敏度为7.8cfu/ml。[结论]建立了快速检测沙门氏菌的LAMP技术,该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,便于在基层推广,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。