百合LiLFY1基因的克隆和表达分析

 【目的】分离百合的LFY类基因,检测百合中LFY类基因的拷贝数并分析其表达模式。【方法】利用 RT-PCR结合RACE的策略克隆百合的LFY类基因,通过Southern杂交检测百合中LFY类基因的拷贝数,通过RT-PCR分析LiLFY1基因的表达模式。【结果】获得了包括全长开放阅读框（ORF）的LiLFY1基因的cDNA序列。与已克隆的LFY类蛋白的同源性分析表明,LiLFY1编码的蛋白与单子叶植物水稻和玉米的LFY类蛋白具有更高的同源性。Southern杂交结果表明,二倍体百合中有2个拷贝的LFY类基因。LiLFY1基因在百合的幼嫩花芽和顶端分生组织中表达,而在根、茎、成熟的叶片和成熟花的各轮器官中不表达。【结论】百合的LiLFY1基因与已克隆的其它作物的LFY类基因高度同源,在百合的顶端分生组织和幼嫩花芽中表达,LiLFY1基因的克隆将有助于调整百合开花时间的基因工程研究。     

百合LoNHX2基因的克隆与表达分析

[目的]为了解决百合在北方盐碱地区百合种球生长和产量的问题.[方法]以OT型百合'Robina'为材料,克隆了百合液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因(LoNHX2),并使用前期试验得出的半致死浓度200 mM NaCl对百合种球进行处理,通过荧光定量分析百合LoNHX2基因在盐处理后不同时间及不同部位的表达状况.[结果]结果表明:(1)百合LoNHX2基因全长为1 608 bp,编码525个氨基酸;(2)百合LoNHX2蛋白性质稳定,由20种氨基酸组成,为脂溶性蛋白;(3) 200 mM NaCl对百合种球根系进行盐胁迫处理后,LoNHX2基因在百合根部的表达量随时间变化,呈先上升再下降趋势;(4)对百合盛花期不同部位中LoNHX2基因表达量分析,LoNHX2基因在花瓣中表达量最高,其次是叶片、茎、根,表达量最低的是鳞茎.[结论]发现百合LoNHX2基因在盐胁迫中有重要作用,可通过降低细胞质中Na+的浓度,从而降低高盐胁迫对植物细胞的伤害.为百合种球耐盐分子育种提供理论依据,对百合在北方产业化发展及园林应用方面具有重要意义.     

细叶百合LpSVP基因的克隆及其表达分析

从细叶百合(Lilium pumilum)中克隆得到LpSVP基因,该基因ORF全长为675bp,编码224个氨基酸。序列同源性和系统进化树分析表明该基因属于MADS-box基因家族下SVP类基因;生物信息学分析表明蛋白相对分子量为25.783kDa,理论等电点为5.62,为亲水蛋白,没有跨膜结构;亚细胞定位预测于细胞核中;蛋白质二级结构a-螺旋占60.71%,随机卷曲占29.02%,延伸链占10.27%;蛋白质三级结构以同型四聚体形式存在。半定量分析表明该基因在鳞茎、叶片、雌蕊、雄蕊和花瓣中均表达,但表达有强弱差异;实时荧光定量分析表明在花发育过程中该基因表达量先增长后下降。该研究为深入了解LpSVP基因功能奠定了基础。     

百合转录辅激活因子Ll MBF1c基因的克隆与表达分析

为了深入研究百合响应高温胁迫的分子机制,本研究以麝香百合杂种系品种白天堂为试验材料,从中分离得到1个MBF1c基因,其开放阅读框为438 bp,编码145个氨基酸,蛋白质分子量为15 900,理论等电点为10. 22。多序列同源比对和进化树分析表明百合MBF1c具有典型的MBF1和HTH结构域,归属c亚型MBF1,因此将克隆到的基因命名为LlMBF1c。亚细胞定位结果表明,LlMBF1c可能介导了热激信号由细胞质向细胞核的转导。实时荧光定量PCR分析结果表明,LlMBF1c在叶中的表达量最高,根中次之,鳞茎中最低; LlMBF1c的表达受热激诱导。表明,LlMBF1c基因可能与百合的热激反应密切相关。     

细叶百合LpWRKY20基因的克隆和表达分析

从细叶百合(Lilium pumilum)中克隆得到LpWRKY20基因,该基因ORF全长为1899bp,编码632个氨基酸,属于WRKY家族Group1;蛋白相对分子量约为68.36ku,理论等电点为5.45,为亲水性蛋白没有跨膜结构;同源氨基酸序列分析显示与海枣(Phoenix dactylifera)同源性达到62%;亚细胞定位显示其在细胞核内表达,具有一般转录因子特性。qRT-PCR分析显示随着鳞茎低温(4℃)储藏时间的增加,该基因的表达量逐渐升高并且在S4时期达到最大,表明其参与调控百合鳞茎休眠解除进程,为进一步了解该基因功能奠定基础。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

百合S-RNase基因cDNA全长克隆及表达分析

[目的]克隆百合S-RNase基因cDNA全长序列并进行表达信息分析,为百合不亲和机制的研究奠定基础。[方法]以东方百合(Lilium oriental)品种‘Justina’为材料,通过RACE技术克隆百合S-RNase基因的cDNA全长序列;采用半定量RT-PCR技术对百合同一时期不同器官的S-RNase基因的表达量进行定性分析;并通过NCBI在线工具以及ProtParam、SignalP、MEGA5对其序列进行生物信息学分析。[结果]克隆基因全长为766bp,开放阅读框为672bp,推导编码223个氨基酸;其半定量分析显示表达量由高到低的器官依次为花瓣、叶、茎、大量分泌液时的花柱、无分泌液时的花柱、鳞茎。通过生物信息学分析发现,该蛋白为一个不稳定的亲水蛋白、存在信号肽序列,属于分泌型蛋白。具有典型的RNase T2家族蛋白保守结构域特征,二级结构富含环形结构。在已知的S-RNase基因中,与野茶树的亲缘关系最近。[结论]获得百合S-RNase基因cDNA全长序列及在同一时期不同器官的S-RNase基因的表达量。     

枸杞LbMYB1基因的克隆与表达分析

在前期的枸杞花药蛋白质组学研究鉴定差异表达蛋白的基础上,采用RT-PCR技术,从宁夏枸杞"宁杞1号"花药中克隆了一个花药发育差异表达MYB类蛋白基因。生物信息学分析表明,该基因编码R2R3类MYB转录因子的典型结构域,与其他物种MYB蛋白的氨基酸的相似性达72%以上,属于R2R3类MYB蛋白基因家族。将该基因命名为Lb MYB1,Lb MYB1包含一个975 bp的开放阅读框,编码324个氨基酸残基,分子量79.2 kv,等电点为4.95。实时定量RT-PCR检测表明,Lb MYB1基因在花药四分体形成时期高丰度表达,在花中的表达量也较高,果实中表达量较低,在根、茎及叶中未检测到表达,推测Lb MYB1基因可能与花药发育中有关。本研究为后继进一步探讨Lb MYB1蛋白在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能及其分子机理提供参考。     

青花菜BoBURP1基因的克隆与表达分析

BURP是一类存在于植物中的特有蛋白,在生长发育和逆境响应等方面起重要作用。试验从青花菜中克隆到一个BURP基因,命名为BoBURP1,在生物信息学分析的基础上,用RT-PCR研究了它在不同器官中的表达模式。研究结果表明,BoBURP1的基因组DNA全长2 030 bp,具2个内含子;编码区全长为1 872 bp,编码623个氨基酸;推导的蛋白质分子量为70.795 6 ku,等电点为8.65。系统发育分析结果表明,BoBURP1与12种不同植物的同源蛋白可分为3组,BoBURP1与十字花科植物同源序列的相似性最高,在进化树上聚为一组。RT-PCR结果表明,BoBURP1在根、茎、叶、花蕾、花和角果中均有表达,叶、花蕾和花的表达量最高,而根和茎中的表达量最低。     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

小麦TaTVP1基因的克隆与表达分析

[目的]发掘并研究小麦TaTVP1基因响应耐盐、耐旱等非生物胁迫的功能与机制,为小麦抗逆育种提供新的基因资源。[方法]利用PCR技术克隆小麦TVP1基因,扩增获得cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,进一步利用qRT-PCR技术分析其表达模式。[结果]小麦TVP1基因全长2 289 bp,编码762个氨基酸;其氨基酸序列具有12个跨膜结构,该结构中疏水氨基酸具有高度保守性,且肽链N末端与C末端均位于膜外,预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D结构蛋白,推测与其具有的H⁺离子泵通道功能密切相关;系统发育树分析表明,TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高,该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群Ⅰ和Ⅱ;定量PCR分析表明,小麦中TVP1基因在根、茎中的表达量要明显高于叶、穗中,具有组织特异性,且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异,这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关。[结论]克隆并分析了小麦TaTVP1基因,为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础。     

蓝莓VcILR1基因的克隆与表达分析

【目的】克隆蓝莓（Vaccinium spp）生长素酰胺水解酶基因VcILR1,分析该基因在蓝莓花、叶、茎、果和根中的表达模式和经过赤霉素处理的青果和成熟果两个时期的表达情况,为进一步探究该基因功能和蓝莓胚珠败育的机制提供依据。【方法】以蓝莓果实的cDNA为模板克隆得到VcILR1基因,利用ProtParam等工具对VcILR1进行生物信息学分析,利用qRT-PCR方法对VcILR1基因在蓝莓不同组织及赤霉素处理的青果和成熟果中的表达量进行分析。【结果】成功克隆到蓝莓VcILR1基因,该基因含976 bp的开放阅读框（ORF）,编码325个氨基酸,有两个保守结构域,分别是Peptidase＿M20和M20＿dimer;编码蛋白的分子质量35 364.20 kDa,理论等电点5.67,不稳定系数43.57,脂肪系数88.55,亲水性平均值-0.054,属于不稳定亲水性蛋白。系统进化树分析表明蓝莓VcILR1基因与山茶科植物的茶树（Camellia sinensis）生长素酰胺水解酶（IAA-Leucine Resistant 1-like,ILL）基因亲缘关系较近。qRTPCR分析结果显...     

细叶百合LpNAC13基因的克隆及其表达

以细叶百合(Lilium pumilum)鳞茎为试验材料,采用RT-PCR方法,克隆得到1个新的NAC转录因子基因,命名为LpNAC13(GenBank登录号MF398204),并用qRT-PCR技术检测该基因在ABA、干旱、低温和高盐胁迫处理下的时空表达。序列分析表明,LpNAC13的开放阅读框为627 bp,编码208个氨基酸,蛋白相对分子质量为20.423 ku,理论等电点为9.58。序列同源性和系统进化树分析表明LpNAC13属于NAC基因家族,与海枣(Phoenix dactylifera)NAC蛋白具有最高同源性,同源性达到56.32%,属于SENU5亚族。实时定量qRT-PCR分析显示,LpNAC13基因能被ABA、干旱、低温和高盐胁迫诱导表达,且在不同植物组织器官中存在表达差异。该研究为深入了解LpNAC13基因的功能奠定了基础。     

3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析

根据已有的白桦Betula platyphylla茎尖、叶片及木质部等45个转录组信息,获得3条白桦BEE基因的全长c DNA序列,分别命名为BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3。对3个BpBEE基因进行了生物信息学分析和实时定量聚合酶链式反应分析,结果表明:3个基因具有典型的结合DNA及特异识别序列E-box和N-box,属于b HLH类转录因子。这3个基因与拟南芥Arabidopsis thaliana中At BEE基因亲缘关系较近,属于b HLH超家族第25亚类。在白桦生长季内,BpBEE1,BpBEE2和BpBEE3在不同组织中均有表达,叶中BpBEE基因表达量明显高于其他部位。在生长旺盛时期,茎、叶和顶芽中BpBEE基因均呈现上调表达,表明BpBEE基因可能参与到白桦的生长过程。油菜素内酯(BR)激素处理之后,BpBEE1在早期(2 h和4 h)的芽和木质部中呈显著上调(2倍);BpBEE2在早期(2 h)的木质部和芽显著上调外,其他处理时间也呈现不同程度的上调。表明3个白桦BpBEE基因参与BR激素应答,且BpBEE1和BpBEE2呈现早期应答响应。     

异育银鲫PTX3基因的克隆与表达分析

为研究Pentraxin 3(PTX3)在鱼类中的作用,克隆得到异育银鲫(Carassius auratus gibelio)PTX3基因,并对其序列结构特征和表达模式进行分析。异育银鲫PTX3序列由3个外显子和2个内含子构成,编码453个氨基酸。异育银鲫PTX3蛋白的前22aa为信号肽,241~453aa为PTX结构域;在PTX结构域有一个非典型的Pentraxin信号。同源进化分析发现,异育银鲫PTX3与其他鱼类聚为一支,且与斑马鱼最为相似(79%);两栖类和哺乳类各自聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,PTX3在异育银鲫的心脏、肝脏、脾脏、头肾、体肾、鳃、脑、肌肉、肠、血液、性腺等11个组织中都有表达。在嗜水气单胞菌攻毒后,肝脏、脾脏、头肾、肠和血液中PTX3mRNA水平都显著上调。在感染后3h,脾脏中PTX3 mRNA水平即出现显著上调;感染后6h,血液中PTX3mRNA水平即达到了峰值。这些结果表明,PTX3作为急相反应蛋白在鱼类受到病原侵袭中发挥免疫保护作用。     

百合单萜合成酶基因的克隆与序列分析

单萜化合物是‘西伯利亚’百合花香的主要成分,为了研究百合单萜化合物的合成与代谢机理,以百合的花瓣为材料,根据GenBank发表的单萜合成酶基因的保守区设计1对简并引物,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA序列,命名为Li-mTPS2。该基因全长为1 766bp,包含1 608bp的基因开放阅读框(ORF),45bp的5′UTR和113bp的3′UTR,编码535个氨基酸,含有萜烯合成酶(TPS)保守序列DDxxD以及TPSb亚家族共有的RRx8W基序。氨基酸同源性分析表明该基因所编码蛋白的氨基酸序列与小苍兰芳樟醇合成酶、姜花单萜合成酶、六出花月桂烯合成酶的同源性分别为55%,53%,51%。     

黄冠梨PbpNCED3基因的克隆与表达

【目的】克隆黄冠梨Pyrus bretschneideri ‘Xuehuali’×P. pyrifolia ‘Shinsseiki’叶片中的9-顺式-环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(NCED)基因的全长cDNA序列,研究不同程度干旱条件下该基因的表达及与叶片内源脱落酸(ABA)的动态变化关系,为明晰该基因在梨树抗旱中的分子机理提供理论依据。【方法】根据转录组数据得到的PbpNCED3序列进行同源序列扩增,通过生物信息学分析确定其属于NCED家族基因。通过酶联免疫吸附法测定不同水分条件下梨叶片内源ABA的含量,通过实时荧光定量测定Pbp NCED3基因的表达量。【结果】Pbp NCED3cDNA序列全长为1 831bp,编码603个氨基酸(GeneBank登录号为:MH749461)。该蛋白具有NCED发挥功能所依赖的4个保守的组氨酸,有NCED家族特有保守结构域序列MIAHPKxDP和HDFAITE及RPE65结构域,N-端含有靶向叶绿体的转运肽。蛋白结构预测发现,该蛋白与玉米vp14(NCED家族蛋白)比对序列相似性为70%,且具有两亲性的α螺旋结构。PbpNCED3基因的表达量与梨叶片ABA的含量成正相关关系(相关系数为0.914),且二者都受到干旱的诱导。【结论】试验所得到的黄冠梨PbpNCED3属于NCED家族基因,该基因响应干旱胁迫,其表达量与内源ABA的含量动态变化趋势一致。