Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达与活性检测

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,亚克隆到pET30a中构建原核表达载体pET30a-LI,并转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。其重组菌株在37℃条件下,经1.0mmol/L IPTG诱导表达重组LI蛋白,该蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的39.2%。采用Ni2 -NTA柱上复性法获得有活性的纯化重组亚油酸异构酶,其比活力5.12U/mg,是天然亚油酸异构酶比活力的2.5倍。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗

利用PCR从自行分离鉴定的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneuromoniae,APP）血清7型菌株基因组DNA中扩增apxⅡA基因，构建了一个利用人类巨细胞病毒（Human cytomegalo virus，HCMV）启动子表达apxⅡA基因的真核表达质粒pCDapxⅡA，体外转染PK-15细胞，处理后的样品进行SDS-PAGE和Western blot分析，证实了免疫原性蛋白apxⅡA在细胞中表达。用表达质粒pCDapxⅡA作为核酸疫苗免疫BALB／c小鼠酶联免疫吸附试验，ELISA检测小鼠血清中特异性抗猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体，结果第2次免疫后其抗体滴度都在1：128以上。初步证实，用apxⅡA作为核酸疫苗免疫动物可以激活机体产生免疫应答反应。     

嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶活性片段的表达和对小鼠的免疫试验

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)J-1株温敏胞外蛋白酶EprJ1的表达产物是否具有酶活性和抗原性及测定对小鼠的相对保护率,根据eprJ1基因ORF阅读框的序列设计1对引物,扩增出不含信号肽序列的EprJ1成熟蛋白结构基因(850bp),经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后连接pET-32a( ),转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21。在30℃经IPTG诱导后,重组菌冻融液在脱脂奶平板上经28℃和24h孵育检测有透明溶蛋白圈出现,经56℃和30min处理后则无。纯化的重组蛋白免疫小鼠后,用1.0×107cfu的AhJ-1(50LD50)腹腔注射攻击小鼠,重组蛋白对小鼠的相对保护率可达60%。免疫印迹显示,AhJ-1胞外产物的抗血清可以识别该融合蛋白,但AhJ-1的热稳定胞外蛋白酶ECPase54抗血清不能识别该融合蛋白。重组蛋白分子量约53.2kD,有温敏蛋白酶活性和抗原性。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

不同剂量CpG-ODN佐剂与ALV-Jgp85重组蛋白联合免疫诱导种母鸡血清抗体和母源抗体的比较

为比较不同剂量非甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)免疫佐剂与J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian leukosis virus,ALV-J)gp85重组蛋白联合免疫后诱导母鸡血清抗体和母源抗体的效果,利用原核表达系统制备包含gp85基因的重组蛋白作为免疫原,与不同剂量CpG免疫佐剂联合接种成年海兰褐父母代种母鸡(Gallus domesticus),首免后2周加强免疫一次,于接种前和接种后每周动态检测血清抗体,接种后部分鸡只每周收集种蛋,检测卵黄抗体。结果显示,利用原核表达系统制备的gp85重组蛋白能与ALV-J单克隆抗体JE9特异性结合;与3个不同剂量CpG联合免疫成年种母鸡后均诱导鸡只产生一定效价的血清抗体,首免后28 d效价最高;所诱导的卵黄抗体效价首免后第4周最高。其中以50μg/羽剂量的CpG联合重组蛋白接种鸡只诱导的血清抗体和卵黄抗体效价和阳性比例最佳,100μg/羽剂量的CpG次之。3个不同剂量的CpG与ALV-J gp85重组蛋白联合免疫均能诱导母鸡产生一定的血清抗体和卵黄抗体,50μg/羽剂量的CpG联合免疫的效果明显优于较高剂量的免疫效果。本研究为使用CpG联合ALV-J gp85重组蛋白诱导母鸡产生母源抗体,阻断ALV-J早期感染提供科学依据。     

麻鸭IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性检测

应用RT-PCR技术,直接从麻鸭(Tadorna ferruginea)脾淋巴细胞总RNA中扩增出麻鸭IL-18成熟蛋白(mDuIL-18)基因,克隆到pGEM-T Easy载体。测序结果表明获得了mDuIL-18基因,其大小为513bp,并将该基因亚克隆到原核表达载体pQE30。SDS-PAGE可检测到分子质量为19.76kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在,经变性和复性处理后明显促进鸭T细胞转化。用mDuIL-18(150或200ng/鸭)和禽流感病毒(AIV)疫苗免疫鸭2周后,血凝抑制(HI)抗体平均滴度达到7.5～7.7log2,而只用AIV疫苗免疫和用mDuIL-18(100ng/鸭)和AIV疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3～6.6log2,表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。     

犬瘟热病毒磷蛋白的表达及抗体制备

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是一种急性高度接触性传染病病原,可引起犬(Canis)、猫(Felis)等多种属动物发热、腹泻、肺炎和中枢神经系统紊乱,其磷蛋白(phospho-protein,P)在病毒复制和致病中具有重要作用。本研究根据犬瘟热病毒P蛋白基因(GenBank No.AF164967)设计引物,RT-PCR扩增得到CDV-P基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-CDV-P,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组his-CDV-P蛋白,His-band纯化后获得高纯度重组蛋白,纯化蛋白免疫balb/c小鼠,制备了小鼠抗CDV-P抗体,检测CDV感染细胞内P蛋白的表达和细胞定位,检测不同感染时间细胞内P蛋白的表达。SDS-PAGE电泳结果表明,获得重组蛋白的分子量大小为65 kD,表达的蛋白以包涵体形式存在,占总菌体蛋白的35%以上,纯化后占总蛋白60%以上;Western blot检测表明,小鼠抗CDV-P抗体能特异性识别原核表达产物和病毒感染表达产物,CDV-P在感染细胞内具有两种表现形式(磷酸化和非磷酸化);间接免疫荧光结果显示,该蛋白在胞浆和胞核中都存在;CDV-P在病毒感染的早期和晚期都有表达,随着感染时间延长表达逐渐增加,并且其磷酸化水平也逐渐增加。本研究制备了重组P蛋白和多克隆抗体,检测了P蛋白在感染细胞内的表达和定位,为P蛋白功能和CDV致病机理研究提供基础资料。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护效果

乳酸球菌(Lactococcus lactis)是一种安全级微生物,为活载体疫苗传递抗原的理想选择.嗜水气单胞菌(A eromonas hydrophila,Ah)能引起鱼类等多种动物的败血病,因其血清型众多,寻找共同保护性抗原是进行疫苗研究的重点.为探究嗜水气单胞菌AS1.927株外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达和检测其表达产物对小鼠的免疫保护效果,本研究将己克隆的ompA基因经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后连接载体pNZ8048,转化乳酸乳球菌NZ9000,nisin诱导表达,并进行SDS-PAGE分析鉴定.结果显示,重组基因工程菌L.lactis[pNZ-ompA]表达的融合蛋白分子量约为36.2 kD,成熟蛋白分子量约为33.7 kD.将重组基因工程菌L.lac tis [pNZ-ompA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),用放射免疫法检测末次免疫一周后的各组小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平以及用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG,结果发现,该重组基因工程菌能显著提高sIgA的分泌(P＜0.05);同时在小鼠血清中的特异性抗体含量也显著高于对照组(P＜0.05).末次免疫两周后用100 LD50的Ah AS 1.927(3.3×105 cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为87.5％,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.该结果将为开发安全有效的口服基因工程鱼用疫苗提供一定的实验基础.     

F18菌毛粘附素F基因(fedF)在大肠杆菌中的表达及对小鼠的免疫保护效果

引起早期仔猪断奶腹泻(PWED)的主要致病菌是产肠毒素型大肠杆菌(ETEC),免疫预防是防治腹泻最主要的手段。本研究采用通过大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组F18菌毛粘附素F(FedF)作为抗原,在小鼠(Mus musculus)中探索以此为靶标免疫防治仔猪腹泻的可能性。根据相应F18菌毛粘附素基因(fedF)设计了一对添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以E.coli F18为模板扩增出全长908bp含20个信号肽序列的fedF片段,并与原核表达载体pET-30a(+)连接,导入大肠杆菌BL21,得到基因工程菌E.coli[pET-fedF],后经IPTG诱导及菌液蛋白电泳分析,结果表明,大小约为32.9kD的重组蛋白FedF可成功诱导表达;将重组工程菌口服免疫BALB/c小鼠,可有效地诱导小鼠血清中FedF特异性IgG的产生(P/N值>2.0)及小鼠肠粘膜sIgA显著增加了2.07倍(与空载体组pET-30比较)(P<0.05);攻毒试验表明,口服基因工程菌E.coli[pET-fedF]可显著地有效保护小鼠免予攻毒死亡,免疫保护率可达62.5%。研究结果提示,FedF黏附蛋白基因工程菌可通过口服诱导小鼠特异的体液和粘膜免疫反应,以此保护小鼠免受产肠毒素型大肠杆菌的进攻,因而有望作为一种口服疫苗防治产肠毒素型大肠杆菌引起的仔猪腹泻。     

酶解处理对小鼠模型中虾主要致敏蛋白的致敏性影响分析

为探究酶解处理对动物模型中虾主要致敏蛋白的致敏性影响,68只雌性BALB/c小鼠随机分为生理盐水对照组、虾致敏蛋白组、酶解虾致敏蛋白组、酶对照组,腹腔注射各组溶液,测定小鼠的脾指数,血清中s Ig G、s Ig E、组胺含量,并观察灌胃处理后的小鼠小肠切片,探究酶解后蛋白的抗原性变化。结果表明,酶解处理使虾中主要致敏蛋白的α-螺旋和β-折叠比例分别下降3.5%和1.5%,β-转角跟无规则卷曲比例分别上升4.3%和1.7%,这些变化使小鼠体内s Ig E水平降低了40.44%。但虾致敏蛋白组的s Ig G和脾指数与酶解蛋白组相比差异不显著,且酶解蛋白组肠切片显示其炎症反应较致敏蛋白组更为明显。综上所述,酶解处理减弱了虾致敏蛋白的抗原性,在一定程度上降低了其致敏性,但是经过多次免疫,酶解后的致敏蛋白在小鼠体内依然能引起很强的过敏反应。本研究为探索致敏蛋白降敏机理提供了技术支撑。     

猪水肿毒素A亚基基因表达产物的生物学特性及抗体检测ELISA方法的建立

根据TMpred生物学软件对SLT-ⅡeA亚基的蛋白质结构分析结果,表达了猪水肿毒素(SLT-Ⅱe)A亚基。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达产物以可溶形式存在,易于纯化且具有良好免疫学活性。生物学毒性试验表明,表达产物不能致死小白鼠,也不具有Vero细胞毒性。体外细胞毒性中和试验表明,表达产物的兔抗血清能中和天然SLT-Ⅱe(中和度90.4℅)。在小鼠免疫保护力试验中,表达产物作为免疫原不能提供任何保护力。以表达产物为抗原建立检测SLT-Ⅱe抗体的间接ELISA方法,结果该方法对猪萎缩性鼻炎等9种常见细菌性疾病阳性血清的检测均为阴性,能特异性检测到人工感染猪水肿毒素8d仔猪的血清抗体IgG,对临床送检的1083份猪血清的检测阳性率为20.9℅。     

SjFer与GM-CSF共表达真核表达载体诱导小鼠免疫保护效果

根据GenBank中SjFer序列设计1对特异引物,以日本血吸虫(Schistosoma japonicum)cDNA文库为模板扩增SjFer基因,常规方法构建质粒pcDNA3.0/SjFer、pcDNA3.0/GM-CSF及pcDNA3.0/SjFer-GM-CSF。85只昆明小鼠分A、B、C、D和E组,分别于0、2和4周通过左后肢股四头肌注射生理盐水50μL/只,质粒50μg/只。感染前和每次免疫前采血收集血清,ELISA检测特异性IgG水平。末次免疫后2周每组随机宰杀小鼠5只无菌取脾,MTT法检测淋巴细胞增殖情况,取免疫部位的肌肉组织通过免疫组化检查重组质粒在小鼠肌细胞内表达情况。末次免疫后2周每只小鼠贴壁感染40±1条尾蚴,45d后宰杀观察减虫率和减卵率。结果表明,重组质粒能在小鼠肌细胞内表达;A、B和C组IgG水平变化不明显,D组和E组可诱导小鼠IgG水平升高,且E组高于D组。淋巴细胞转化试验结果A、B和C组OD570变化不明显,彼此无显著差异,D组和E组脾淋巴细胞转化率明显增加,与对照组差异显著,且E组OD570明显高于D组。D组和E组可诱导小鼠产生36.27%和39.22%的减虫率、36.10%和49.04%的减卵率。GM-CSF可增强体液和细胞免疫应答并显著增强pcDNA3.0/SjFer的免疫保护力。     

肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白的表达及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因,并定向克隆到pET-32α( )中,转化宿主菌(E.coli)BL21(DE3)。重组菌经1mmolLIPTG诱导,在30℃下,5h时表达产物(分子量约为37kD)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中,经Westernblot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种实验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠,对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2（POIL-2）嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus typc 2,PCV2)核酸疫苗,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过--基因柔性接头(linker)(G4S)3,将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2成熟肽基因(PoIL-2)构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光和PoIL-2蛋白ELISA方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋(rCap-linker-PoIL-2)生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒PcDNA3.1/OFR2(rpcDNA3.1/OFR2)免疫Balb/c小鼠并检测其免疫效果.结果表明,成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1( )重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞浆内进行了表达,表达的rCap-linker-PoIL-2融合蛋白可分别与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap和PoIL-2蛋白的双重生物学活性;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2.     

猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果研究

摘要：为了研究猪圆环病毒2型（PCV2）核酸疫苗,本研究采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension-PCR , SOE-PCR）方法通过一基因柔性接头（linker）(G4S)3将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2的成熟肽基因（PoIL-2）构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,对阳性重组质粒进行双酶切后回收嵌合基因亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒（rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2）瞬时转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光试验和PoIL-2蛋白ELISA试验方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋白(rCap-linker-PoIL-2 )生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2免疫Balb/c小鼠,采用PCV2抗体ELISA检测试剂盒检测rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在小鼠体内的免疫效果,并与只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒pcDNA3.1/OFR2 (rpcDNA3.1/OFR2)进行免疫效果比较。结果表明：成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1(+)重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞内进行了成功表达,表达的rCap-linker-PoIL-2蛋白存在于COS-7细胞的细胞浆内,可与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap蛋白和PoIL-2蛋白的双重生物学活性; rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导小鼠产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2。本研究为PCV2的核酸疫苗研制奠定了基础。     

重组蛋白H-NS对胸膜肺炎放线杆菌生物被膜形成的影响

在筛选胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacills pleuropneumoniae,APP)转座突变体库时,发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清l型生物被膜的形成,该基因编码一种DNA结合蛋白(组蛋白样类核结构蛋白,H-NS).为了进一步研究H-NS对APP生物被膜形成的影响,实验以APP血清l型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408 bp的hns基因编码区,并克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET28c-hns,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19 kD的重组蛋白rH-NS.将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成.结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1～0.3μmol/L rH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成昔随着rH-NS浓度的升高而降低.而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4 μmol/L对两个菌株生物被膜形成未见明显影响.结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应.     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠免疫试验

将纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒利用杆状病毒表达系统进行表达,表达产物应用SDS-PAGE、Western blot和Dot ELISA进行分析,确定所表达的蛋白分子量大小约为67kD,且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察,可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的灭活疫苗免疫组及磷酸盐缓冲液(PBS)接种组作为参比对照,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明,表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒,不仅能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,还能刺激小鼠产生高效价的抗猪细小病毒的特异性抗体,而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

重组猪胸膜肺炎放线杆菌NLPI蛋白诱导小鼠抗攻击感染的免疫保护力研究

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是猪(Sus scrofa)的一种呼吸道疾病,影响世界养猪业,其病原菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP),现有疫苗由于保护效果不甚理想,因此有必要寻找新的疫苗候选分子。本研究检测了猪APP重组NLPI蛋白(recombinant NLPI,rNLPI)的免疫保护作用。根据Gen Bank中已报道的APP nlpi基因序列设计引物对,然后以APP的基因组为模板PCR扩增nlpi基因,测序后进行生物信息学分析,发现该基因(Gen Bank No.:MH027649)由900 bp组成,编码1个含299个氨基酸的蛋白质,为一外膜脂蛋白,此外膜蛋白在多种APP血清型之间具有很高同源性。将nlpi基因亚克隆至p ET32a(+)载体,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达APP rNLPI,并经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)和蛋白质印迹(Western blot,WB)确认。结果表明,在34 k D处有特异性条带,可被相应的阳性血清识别。动物保护实验采用BALB/c小鼠(Mus musculus)进行,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)用于测定免疫球蛋G(immunoglobulin G,IgG)抗体滴度。结果表明,弗氏不完全佐剂+50μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+30μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+10μg rNLPI、30μg rNLPI免疫后,可诱导小鼠分别产生40%、20%、10%和20%的存活率;佐剂组和生理盐水对照组存活率为0。幸存小鼠慢慢恢复健康,并正常采食。可见,rNLPI皮下免疫可诱导小鼠产生免疫应答和较高的抗攻击感染的免疫保护力。该研究结果为进一步筛选猪传染性胸膜肺炎分子疫苗积累了基础资料。     

融合Strep-tag Ⅱ标签灵杆菌核酸酶的重组表达与催化特性分析

灵杆菌(Serratia marcescens)核酸酶高效的核酸去除能力与较强的稳定性使其在生物医药领域有广泛的应用,而如何高效去除反应体系中添加的微量核酸酶成为了重要的生产问题.为建立反应后核酸酶的快速去除系统,本研究构建了融合Strep-tagⅡ标签的灵杆菌非特异核酸酶(Strep-tag Ⅱfused non-specific nuclease,SNU),并对融合蛋白的催化特性以及去除效果进行分析.依据灵杆菌核酸酶基因序列,设计融合Strep-tagⅡ编码序列的引物克隆目标基因并构建融合表达载体pLLP-OmpA+snu,并将测序正确的重组质粒转化宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli) BL21并进行诱导表达.融合Strep-tag Ⅱ的核酸酶以包涵体形式过量表达,通过优化包涵体纯化条件获得高纯度包涵体.经包涵体复性可获得高活性的融合蛋白,复性率大于60％.复性蛋白经二乙氨基乙基(diethylaminoethyl,DEAE)-琼脂糖凝胶(sepharose)阴离子交换层析进一步纯化获得了高纯度的融合蛋白.融合蛋白的纯化效率可以达到18.695 mg/L.活性检测表明该融合蛋白能够高效降解DNA与RNA,其最适温度为37℃,最适pH为8.0,比活力达到1.53×105 U/mg.500 mmol/L以下尿素对酶活性几乎没有影响,而高于50 mmol/L MgC12、大于2 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)则会对活性产生一定的抑制作用.不同二价金属离子对酶活性影响的分析表明,Mg2+和Mn2+对重组核酸酶活性有明显的促进作用,Zn2+、Cu2+和Ca2+则没有促进作用,而Co2+、Ni2+和Fe2+对重组核酸酶的活性促进不显著.通过链霉亲和素(Streptavidin)-Sepharose CL 6B能够实现融合Strep-tagⅡ标签的核酸酶的高效去除.融合Strep-tagⅡ标签的灵杆菌非特异核酸酶的重组表达、包涵体纯化-复性体系以及去除系统的建立为灵杆菌非特异核酸酶的实践应用提供了基础资料.