猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式PCR方法明显优于血涂片染色镜检法及常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。     

奶牛附红细胞体感染PCR诊断方法的建立

为建立特异、敏感、快速的奶牛附红细胞体感染诊断方法，该研究根据本实验室已测得的奶牛附红细胞体16S rRNA基因序列，设计1对种特异性引物，建立了奶牛附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明，该诊断方法与猪肺炎支原体、鸡毒支原体、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫无交叉反应，能检测的奶牛附红细胞体最低DNA量为0．154fg，同时能检测出在4℃存放长达3个月的血样。通过临床血样检测，证明该方法可用于本病的早期诊断。     

牛附红细胞体病PCR诊断方法的建立

根据已报道的牛附红细胞体16S rRNA的序列设计1对特异性引物,进行PCR.将PCR产物克隆并测序,结果显示所得基因片段为667 bp,与GenBank上Mycoplasma weyonii序列同源性达到98.83%.试验建立的PCR诊断方法特异性强,与健康牛血液、牛无乳链球菌、金黄葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌的DNA无交叉反应,能检测的牛附红细胞体最低DNA质量浓度是13.6 ng/L.应用该方法对130个奶牛血样进行牛附红细胞体病检测,结果表明总阳性感染率为24.62%.该方法具有快速、准确、敏感等特点,为牛附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供新的手段.     

猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立

猪附红细胞体病是由猪附红细胞体(Eperythrozo on suis)寄生于猪红细胞表面或游离于血浆及骨髓中引起的,以仔猪发热、贫血、黄疸和母猪流产等症状为特征.传统的外周血液涂片检查方法常常受到血液里不明微生物、非病原性物质和染料颗粒等因素的干扰.血清学中的IHA试验、CFI或ELISA等方法的敏感性和特异性也存在一定局限性.     

猪附红细胞体巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立一种更加准确、敏感的猪附红细胞体检测方法,本试验根据猪附红细胞体特异的DNA序列(AJ504999)设计2对巢式PCR引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该检测方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR对猪附红细胞体基因组DNA能扩增出特异性片段,而对弓形虫、链球菌、牛瑟氏泰勒虫、牛附红细胞体基因组DNA扩增反应结果均为阴性;DNA最低检测量为0.124 fg/μL;通过对55份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR的阳性检出率高23.7%。本试验为猪附红细胞体病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了1对引物，分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板，采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，确定特异性产物的Tm值，同时做普通PCR。试验结果表明，特异性产物的Tm值为88．5℃，最低能检测到含0．036fg／μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性，为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

羊附红细胞体巢式PCR检测方法的建立及临床应用

根据GenBank上发表的羊附红细胞体16SrRNA基因序列（登录号AF338268）设计2对引物,用巢式PCR方法扩增16SrRNA的部分序列,将目的片段克隆并测序。测序结果与AF338268相似性达99%以上,只有3bp的差异。该方法与猪附红细胞体、羊肺炎支原体、链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌均无交叉反应,能检测到的最低DNA量为25fg。用于检测的28份临床样本中,23份为阳性。所建立的巢式PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于羊附红细胞体病急性感染和隐性感染的早期诊断,为该病的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供了新的技术手段。     

猪附红细胞体病三种诊断方法的比较

采集了甘肃省内3个规模猪场的血液样品300份,分别用显微镜检测、ELISA、PCR方法进行比对实验,比较三种检测方法的特异性和敏感性。结果表明,显微镜检测存在较高的假阳性,PCR的特异性和敏感性最好,分别达到93.3%和95.7%。进行监测时,建议选择镜检和PCR的联合诊断方法。     

猪附红细胞体病的防治研究

近几年在我国各地，相继在牛、羊、猪、犬等动物中查到附红细胞体，尤其以猪最为严重。自2000年夏秋以来，猪附红细胞体病在山东、河南、辽宁、江苏、河北等部分地区呈现较大规模流行趋势，给养猪业带来了很大的经济损失。笔者根据自己的诊疗经验，结合国内一些诊治研究，对猪的附红细胞体病进行简要概述，供广大畜牧兽医工作者参考。     

再议猪附红细胞体病的诊治

猪附红细胞体病,1990年前后在本县发生并流行,笔者也曾对本病进行过小结,并有拙文发表,后来本病在本县日趋少见。2002年3月份以来,本县再次发生本病并出现较大范围的流行。通过与同行之间交流了解到,自2000年以来,本病在福建、河南、安徽、江西等省份就出现了较大面积的流行,对养猪业的危害较大,各类杂志也有许多相关的报道。通过查阅资料发现,大家对本病的了解有许多出入之处,甚至出现相左的观点。笔者通过再次对多例猪附红细胞体病的诊治和查阅有关资料,对本病有了进一步的认识。现总结如下,供同行特别是新发病区的同行参考。1病原本病病…     

猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较.结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868 bp(GenBank登录号为;JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99％,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断.     

山羊和绵羊嗜血支原体PCR检测方法的建立与应用

为建立羊嗜血支原体(M.ovis)病快速检测方法,本实验根据GenBank中登录的羊M.ovis 16S rRNA基因序列设计一对引物,以山羊和绵羊M.ovis基因组DNA为模板,建立M.ovis PCR检测方法,并进行特异性、敏感性及临床应用试验。结果显示,建立的M.ovis PCR检测方法扩增片段大小为508 bp,与GenBank中M.ovis参考株同源性达99%以上,该方法与猪嗜血支原体、牛嗜血支原体等病原体无交叉反应,最低检测40个拷贝的DNA;通过对延边地区60份山羊和绵羊血液样本的检测结果表明,建立的PCR检测方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于M.ovis的检测。     

血液直接PCR方法在猪嗜血支原体检测中的应用

为临床上能快速准确检测猪嗜血支原体感染,建立了一种检测猪嗜血支原体的血液直接PCR方法。该方法能特异性地扩增猪嗜血支原体16SrRNA基因中的一段396bp序列,而对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等没有扩增到目的条带;该方法能检测到每微升抗凝血中猪嗜血支原体的最低拷贝数为5.52×101 copies,与常规PCR相当;应用血液直接PCR和常规PCR对100份抗凝血样进行检测,阳性检出率分别为65%和69%,差异不显著(P0.05)。结果表明,血液直接PCR方法具有良好的特异性、较高的灵敏度和较快的检出速度,适用于临床上对猪嗜血支原体感染进行快速确诊和流行病学调查。     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16SrDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型（1或／和2型）型特异基因序列设计了4条引物，建立了快速检测猪链球菌2型（1或／和2型）的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示，所建立的多重PCR方法特异、敏感，对组织中的猪链球菌2型（1或／和2型）的最低检出水平为30CFU／mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测，并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证，结果显示，检出阳性符合率为100％，证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立

为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。     

Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycoplasma suis (Eperythrozoon suis) in porcine blood

An efficient method of control of porcine eperythrozoonosis (PE) caused by Mycoplasma suis is eradication of infection by detection and removal of infected carrier animals. At present, only a few tests are available for the diagnosis of these latent M. suis infections in pigs. The objective of this study was to develop a PCR assay based on novel DNA sequences for the identification of M. suis-infected pigs. A 1.8 kb EcoRI DNA fragment of the M. suis genome was isolated from the blood of pigs experimentally infected with M. suis. Specificity of the DNA fragment was confirmed by DNA sequence analysis and PCR using primers directed against sequences contained in the 1.8 kb fragment. PCR products of 782 bp in size were amplified only from M. suis particles prepared from the blood of experimentally infected pigs but not from any controls, comprising blood from gnotobiotic piglets and a panel of bacteria including other porcine mycoplasmas. PCR results were confirmed by dot blot hybridisation. The applicability of the PCR assay to diagnose M. suis infections in pigs was evaluated by investigating blood samples from 10 symptomatic pigs with clinical signs typical of porcine eperythrozoonosis and blood samples from 10 healthy pigs. The M. suis-specific PCR product was amplified from all samples taken at episodes of acute disease as well as from samples taken during the latent stage of infection, thus demonstrating the suitability of the PCR assay for detecting latent infected carrier animals.