嗜水气单胞菌外毒素免疫血清的制备及其对中华鳖红底板病的防治 …

将致病性嗜水气单胞菌扩大培养后提纯外毒素，用灭活外毒素免疫大白兔，制备免疫血清，再用兔免疫血清防治鳖红底板病。结果表明：对攻毒后１ｄ的中华鳖用免疫血清进行治疗，其成活率为３７．５％，对免疫后攻毒的中华鳖的保护率大于７５％。     

中华鳖细菌疫苗免疫佐剂的筛选及其初步应用

将分离自中华鳖Trionyx sinensis主要细菌性疾病—肠道出血性败血症、鳖穿孔病（疖疮病）、红脖子红底板病、鳖腐皮病的4株病原菌,在体积分数为3．5％的福尔马林溶液中灭活24h。在灭活的4株菌中添加不同佐剂,充分混匀后分别制备成总含菌量为6×10^9个／mL的4价菌苗,分别免疫8只ICR小鼠,并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。经3次免疫后,随机选3只小鼠抽血制备血清,用间接ELISA方法测定抗体效价,除空白对照组外,其它4组小鼠的免疫血清效价为1：1．6×10^4-1：2．56×10^5,各免疫组的效价依次为弗氏佐剂〉白油佐剂〉蜂胶佐剂〉不加佐剂。另外5只小鼠用于免疫保护性试验。结果表明：3种佐剂的免疫保护率均为100％,而不加佐剂组免疫保护率为80％,空白对照组死亡率为100％。考虑到弗氏佐剂的成本较高且白油佐剂有副作用,故选择蜂胶作为免疫佐剂,制备了中华鳖4价菌苗。用该菌苗免疫接种50只体重为100～150g／只的健康中华鳖,注射剂量为0．2mL／只,并设置对照组（注射等量的生理盐水）,共接种20只健康中华鳖。分别于免疫后第20、30、40、50天随机采集3只受免疫的中华鳖和对照组的1只中华鳖血液并制备血清,用浙江省淡水水产研究所制备的针对中华鳖IgM的单抗3H3介导的ELISA方法,测定血清中的抗体效价。结果表明：当中华鳖免疫后40d,血清中抗体效价达到最高,为1：6．4×10^4;免疫后50d将受免中华鳖分成4组,分别用4种菌株以5LD50（9×10^6个／mL）进行攻毒试验（0．5mL／只）,结果免疫保护率均达到100％,而对照组死亡率均为100％。     

2种复方制剂对中华鳖非特异性免疫功能的作用效果

为芪草多糖、金莲免疫散复方制剂在中华鳖养殖上的应用提供科学依据,以中华鳖稚鳖饲料(CP47)为基础饲料,分别添加金莲免疫散和芪草多糖复方制剂2g/kg饲养60d后,测定中华鳖血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、碱性磷酸酶和溶菌酶活性,分析2种复方制剂对其非特异性免疫功能的影响,并利用嗜水气单胞菌1×109cfu/mL进行攻毒试验,测定其存活率。结果表明:与对照组(只喂基础饲料)相比,饲料中添加金莲免疫散能显著提高中华鳖的碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性;芪草多糖能显著提高超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性;金莲免疫散组、芪草多糖组的攻毒存活率分别比对照组高15.78百分点和13.56百分点,证明2种复方制剂能提高中华鳖的非特异性免疫功能。     

嗜水气单胞菌BA-ELISA的建立及其在病原检测中的应用

从中华鳖中分离的嗜水气单胞菌致病株T0608经福尔马林灭活后,注射免疫新西兰兔,制备了高价免疫血清,血清的菌体凝集效价可达1/1 280;G蛋白亲和层析纯化兔IgG,将IgG用生物素标记,建立了生物素-亲和素双抗体夹心酶联免疫吸附法(BA-ELISA);其最低检出限为2.5×103cfu,相当于0.5 ng菌体蛋白,其检测灵敏度为ABC-ELISA(4.0×104cfu)和间接ELISA(4.0×104cfu)的16倍;特异性试验结果表明,本法与鱼类气单胞菌、拟态弧菌、海豚链球菌、大肠杆菌等无交叉反应.BA-ELISA可不经细菌培养直接检测人工感染48 h中华鳖的肝、肠道组织中的嗜水气单胞菌.用该方法对湖州市龟鳖养殖场的水样、中华鳖和巴西龟肝、肠道内容物进行检测.结果表明该方法可较好地应用于发病中华鳖的病原早期诊断及养殖中华鳖的病原检测.     

中华鳖穿孔病的免疫预防研究

选择中华鳖毒力最强的嗜水气单胞菌Ｃ－３菌株和产碱假单胞菌Ｃ－２菌株,制成福尔马林灭活二联菌苗及Ｓｐａｎ白油佐剂菌苗,对中华鳖进行了注射免疫试验。通过检测血清中的凝集抗体产价,血液和脾脏中吞噬细胞的吞噬活性和测定强毒攻击的免疫保护率,证实了２种免疫原对中华鳖均具有较强的的免疫原性,免疫保护率达９０５以上。     

用低龄动物制备高效价Et免疫血清的探讨

［目的］建立一种用低龄日本大耳白兔制备高效价迟钝爱德华氏菌（Edwardsiellatarda,Et）免疫血清的方法。［方法］先制备迟钝爱德华氏菌（Et）抗原。用日本大耳白兔作免疫动物,分2组试验,一组是2月龄组（T组）,另一组是6月龄（S组）。采取耳缘静脉注射的方法,小剂量连续多次免疫日本大耳白兔,免疫后,收集免疫血清,然后用微量凝集反应法测定免疫血清抗体效价。［结果］凝集反应显示,在免疫剂量相同的情况下,第1次试血测Et免疫血清效价,S组的血清效价比T组的血清效价高,但在第2次试血测Et免疫血清效价时T组的血清效价与S组的血清效价一致。［结论］试验中所采用的T组动物（日本大耳白免）月龄较小,免疫后仍产生了与S组一致的高效价抗血清,说明用低龄日本大耳白兔制备高效价Et免疫血清的方法可行。     

左旋咪唑对金黄色葡萄球菌粘附素 ClfA重组 DNA 疫苗免疫效果的影响

为了探究左旋咪唑（LMS）作为免疫增强剂对金黄色葡萄球菌粘附素 ClfA 重组 DNA 疫苗免疫效果的影响.分别用含左旋咪唑的 ClfA 重组 DNA 疫苗、ClfA 重组 DNA 疫苗及空载体免疫昆明白小鼠,通过巨噬细胞吞噬试验、MTT 实验、免疫血清对金黄色葡萄球菌识别能力、酶联免疫吸附试验和攻毒试验验证免疫效果.结果表明,含左旋咪唑 DNA 疫苗组在巨噬细胞吞噬指数、脾脏淋巴细胞增殖、免疫血清对金黄色葡萄球菌识别能力方面有增强作用,与其他两组相比差异显著（P ＜0．05）,含左旋咪唑 DNA 疫苗组小鼠抗体水平及攻毒实验保护率高于单独 ClfA 重组 DNA 组和空载对照组,LMS 能够对 ClfA 重组 DNA 疫苗免疫效果起到增强作用.     

滴鼻免疫布氏菌活疫苗保护效果的研究

为评价布氏疫苗通过滴鼻方式免疫豚鼠的免疫保护效果,将60只豚鼠随机分为3组,滴鼻免疫布氏菌活疫苗,免疫30 d后进行心脏采血,制备肺泡灌洗液以及鼻腔灌洗液。ELISA法检测免疫动物血清中IgG抗体和免疫动物肺泡灌洗液、鼻腔灌洗液中IgG、IgA抗体;通过迟发型皮肤超敏实验进行体内细胞免疫评价;用羊布氏菌弱毒株M5经皮下和滴鼻两种途径攻击免疫动物,通过脾脏细菌计数评价布氏菌活疫苗的主动免疫保护力。取40只小鼠随机分为8组,将豚鼠免疫血清对小鼠进行腹腔注射,2 h后皮下攻击M5羊布氏菌弱毒株,通过脾脏细菌计数评价免疫血清的被动免疫保护力。用ELISA法检测到经布氏活疫苗免疫的豚鼠体内有特异性抗体产生;疫苗免疫动物对Br PPD抗原迟发型超敏反应（DTH）阳转率均为100％;通过布氏菌活疫苗保护力分析,表明该疫苗的主动免疫以及免疫血清的被动免疫都具有较好的保护效果。布氏菌活疫苗采用滴鼻方式免疫豚鼠,免疫后能获得较好的免疫保护效果。     

用低龄动物制备高效价Et免疫血清的探讨

[目的]建立一种用低龄日本大耳白兔制备高效价迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda,Et）免疫血清的方法。[方法]先制备迟钝爱德华氏菌（Et）抗原。用日本大耳白兔作免疫动物,分2组试验,一组是2月龄组（T组）,另一组是6月龄（S组）。采取耳缘静脉注射的方法,小剂量连续多次（第1、7、14、21、27、33、41天时免疫剂量分别为O．2、0．2、0．25、0．2、0．25、0．3、0．4ml）免疫日本大耳白兔。免疫后,收集免疫血清,然后用微量凝集反应法分2次试血（第1次是免疫第33天后的第7天,采用1：20抗血清;第2次是免疫第41天时,采用1：40抗血清）,测定免疫血清抗体效价。[结果]凝集反应显示,在免疫剂量相同的情况下,第1次试血测＆免疫血清效价,2月龄组T：血清效价最高为1：640,6月龄组S1、S2和S4血清效价均达1：1280,显示6月龄组的体液免疫应答反应强于2月龄组;经继续免疫8d后,第2次试血测凸免疫血清效价可见,2月龄组的T1、T2、T3和6月龄组的S1、S2、S4免疫血清效价一样,均高达1：5120。表明此时在接受相同剂量助抗原刺激后,2月龄组和6月龄组的体液免疫应答反应已趋相同。[结论]试验中所采用的T组动物（日本大耳白兔）月龄较小,免疫后仍产生了与S组一致的高效价抗血清,说明用低龄日本大耳白兔制备高效价凰免疫血清的方法可行。     

牛血液型研究(Ⅰ)——关于延边黄牛血型抗原的免疫应答

选择20头健康的延边黄牛,作为免疫群。用43种国际标准抗血清检查了牛的血型,确定了20对免疫组合。免疫实验采用了同种免疫方法,免疫间隔为7天,免疫次数为5次。第一次免疫后,在20个免疫受体,都产生了免疫抗体。用倍数稀释法测定了每次免疫注射后的抗体价。第一次免疫后,免疫血清的抗体价在1:32～1:52,平均1:204.8;第三次免疫后,免疫血清的抗体价在1:256～1:2048,平均1:973.8;第五次免疫后,多价抗血清的抗体价在1:512～1:16,384,平均1:5,196.9。通过实验得知,已产生数十种抗体种类,抗体价随着免疫次数的增大而逐渐递增,其幅度随个体而异。     

斑点叉尾鮰对3种致病菌灭活菌苗的免疫应答

将经福尔马林灭活的柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi-la)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)作为免疫原,分别接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatusRafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性及用A.hydrophila活菌攻毒的方法,探讨了斑点叉尾鮰对3种灭活菌苗的免疫应答状况。试验结果表明,对斑点叉尾鮰经腹腔注射接种3种灭活菌苗能刺激受免鱼产生较强的免疫应答,受免鱼产生了对3种致病菌的特异性凝集抗体和交叉凝集抗体,与未接种菌苗的对照鱼相比,受免鱼头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性明显上升,活菌攻毒的结果也证明了受免斑点叉尾鮰对C.columnaris,A.hydrophila和E.ictaluri产生了不同程度的相对免疫保护率(RPS)。     

中华鳖对嗜水气单胞菌粗脂多糖(LPS)的免疫应答

将采用温酚法从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)中提取的粗脂多糖(crude lipopolysaccharide,LPS)作为免疫原,注射接种中华鳖(Pelodiscus sinensis)后,通过测定受免鳖的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和对A.hydrophila活菌细胞内杀菌活性,比较了3种致病菌的粗LPS对中华鳖的免疫原性。试验结果表明,从3种致病菌中提取的粗LPS对中华鳖均具有较强的免疫原性,受免鳖的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鳖相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A.hydrophila活菌杀菌活性明显上升。说明在3种供试菌的粗LPS上不同程度地存在3种致病菌的共同保护性抗原。     

斑点叉尾鮰对3种致病菌外膜蛋白(OMP)的免疫应答

利用从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)中提取的外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)作为免疫原,注射接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus Rafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和采用A. hydrophila活菌攻毒方法,比较了3种致病菌OMP对斑点叉尾鮰的免疫原性。试验结果表明:从3种致病菌中提取的OMP对斑点叉尾鮰均具有较强的免疫原性,受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鱼相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A. hydrophila活菌攻毒的相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)明显上升。说明在3种供试菌的OMP上不同程度地存在共同保护性抗原。     

鲤细菌性败血症的免疫研究

选取分离于鲤细菌性败血症病例的嗜水气单胞菌强毒力菌株进行复壮,于菌悬液中加入0.2%甲醛于28℃灭活12h制成灭活疫苗,对鲤进行免疫接种后,通过检测抗体,以确定鱼体对疫苗的应答强度。分别取注射免疫后第21,28,35,42天的血清做凝集试验,并于首免6周后做人工感染保护试验。结果抗体最高效价达到212,而对照组为0。受免组攻毒免疫保护率达90%,表明鱼体对嗜水气单胞菌灭活疫苗可以产生免疫应答,对鲤有一定的免疫保护作用。     

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌灭活菌苗免疫保护及药物治疗试验

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌培养物经甲醛灭活后,制成灭活油乳剂苗、灭活菌苗、饵料吸附型疫苗,免疫罗非鱼2周后,分别以嗜水气单胞菌、爱德华氏菌活菌液攻毒,结果显示,注射型疫苗均优于口服型,其中嗜水气单胞菌以腹腔注射0．1mL嗜水气单胞菌灭活菌苗＋0．3mL生理盐水的效果最佳,免疫保护率为85．0％;而爱德华氏菌以腹腔注射0．4mL灭活油乳剂苗效果最佳,免疫保护率为90．0％。两者的药物治疗试验结果显示,以氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸治疗罗非鱼嗜水气单胞菌病、爱德华氏菌病均有一定效果,对减少发病率及死亡率、控制病情具有较好作用,其中以氟苯尼考的疗效最佳,其用量为20mg／kgH2O。     

嗜水气单胞菌3种疫苗免疫的青鱼外周血免疫指标的变化

将福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、菌体外膜蛋白(OMP)和菌体脂多糖(LPS)作为免疫原,分别免疫健康青鱼。在免疫1、2、4、7、14、21、28d后进行外周血的血细胞计数和白细胞分类计数,测定细胞吞噬活性和抗体效价,结果表明:3种免疫原均可诱导红细胞和白细胞数量增加,并引起各种白细胞分类百分比变化,提高吞噬活性和抗体效价;免疫应答早期(第1周)主要是红细胞、单核细胞和中性粒细胞数量明显增加,吞噬细胞的吞噬活性迅速提高,吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)第4天达峰值,F-AH组、OMP组和LPS组的PP、PI值依次分别为39.84%、46.53%、41.59%及3.94、4.26、3.77;随后则是淋巴细胞大量增殖,第21天淋巴细胞数量和抗体效价达峰值,F-AH组、OMP组和LPS组的抗体效价分别为1∶426.67、1∶341.33和1∶213.33。免疫28d后活菌攻毒的结果表明,OMP组的免疫保护率为75%;LPS组为67.8%,均明显优于F-AH组(50%)。可见3种免疫原均能通过促进青鱼血细胞增殖、提高吞噬细胞的吞噬活性、产生特异性抗体等方式增强机体的免疫保护力。     

3种鱼类致病菌粗脂多糖(LPS)对斑点叉尾鮰的免疫原性

用温酚法分别从柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)3种鱼类致病菌中提取粗脂多糖(LPS)作为免疫原,分别接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatusRafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性以及对A.hydrophila活菌细胞内的杀菌活性,探讨了3种致病菌的粗LPS对斑点叉尾鮰的免疫原性。结果表明,从3种致病菌中提取的粗LPS对斑点叉尾鮰均具有较强的免疫原性,受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鱼相比,头肾和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A.hy-drophila活菌杀菌活性明显上升。说明在3种供试菌的粗LPS上不同程度地存在3种致病菌的共同保护性抗原。     

患红底板症的中华鳖幼鳖的病原菌分离与鉴定

【目的]为中华鳖红底板病病原鉴定和防治提供参考依据。[方法]从患红底板症的中华鳖幼鳖的血、心、肝、脾、肠等组织中分离病原菌,并进行形态学观察、16SrDNA序列分析鉴定及药敏试验。[结果]从中华鳖中分离到2株细菌,分别为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和格氏乳球菌（Lactococcus garviae）。人工感染试验结果表明2株分离菌对中华鳖都有致病性;用含有抗生素的20种药敏纸片进行药敏试验,发现该株嗜水气单胞菌对复达欣高敏,对呋喃妥因中敏,对其他18种药物耐药;该株格氏乳球菌对复达欣、万古霉素、呋喃妥因、妥布霉素、头孢唑啉等5种高敏,对庆大霉素、卡那霉素、头孢西丁等3种中敏,而其他13种药物耐药。[结论]从中华鳖幼鳖中分离的2株细菌具有较强的致病性和耐药性。     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。     

黄鳝出血病三联微胶囊口服疫苗制备及免疫效果研究

【目的】制备出能有效防御黄鳝出血病的三联微胶囊口服疫苗,促进黄鳝养殖业健康发展。【方法】以嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌及温和气单胞菌为抗原,海藻酸钠为壁材,利用乳化法制备三联微胶囊口服疫苗,然后直接拌入饵料对健康黄鳝进行口服免疫,7 d后进行加强免疫,测定各项血清免疫指标。加强免疫结束15 d后,经腹腔注射3种活菌(1.0×109 CFU/mL)进行攻毒试验,检验三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护率。【结果】制备获得的三联微胶囊口服疫苗的平均粒径为44.5μm,平均含菌量为4.56×109 CFU/mg。按0.4和0.6 g/kg的剂量口服免疫黄鳝,其血清补体C3含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性均显著高于对照组(P<0.05),血清平均抗体效价分别为7.5949和11.0651,对应的免疫保护率为60%和65%,且0.6 g/kg剂量组的各项指标均高于0.4 g/kg剂量组。【结论】制备获得的三联微胶囊口服疫苗能显著提高黄鳝血清SOD、ACP活性及刺激血清补体C3产生,有效抵御由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌引起的出血病,生产使用时须进行加强免疫,并适当加大免疫剂量。