美国转Bt基因抗虫玉米研究进展

欧洲玉米螟Ｏｓｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌｉｓ（Ｈｂｎ．）是北美严重影响玉米产量和品质最重要的害虫，转Ｂｔ基因抗虫玉米（以下简称Ｂｔ玉米）的商品化，为控制玉米螟为害提供了新的途径。一、Ｂｔ玉米的培育植物遗传研究人员将选定的外源ＤＮＡ插入玉米植株的ＤＮＡ...     

转Cry抗虫基因玉米对家蚕的安全性评价

家蚕可能通过取食漂移到桑叶上的玉米花粉从而受到转基因玉米中表达的Cry蛋白的影响。实验采用室内生物测试的方法评价了转cry1Ab和cry2Ab基因玉米GAB-3花粉对家蚕可能产生的影响,并采用在饲料中掺入蛋白的方式检测了转基因玉米中广泛使用的6种Cry杀虫蛋白对家蚕的毒性。当桑叶上GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,对家蚕幼虫存活率无显著影响,达500粒·cm^-2时,家蚕14 d存活率为0;以10粒·cm^-2的GAB-3花粉饲喂家蚕幼虫7 d对其体重无显著不利影响,但延长饲喂时间或者当GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,家蚕的体重显著低于对照组;转基因和非转基因玉米花粉处理14 d或更长时间的家蚕体重均低于无花粉处理组。与非转基因对照处理组相比,低于100粒·cm^-2的转基因玉米GAB-3花粉处理组家蚕的化蛹率、茧重、茧壳重和蛹重无显著差异,转基因玉米和非转基因玉米花粉处理均会延长家蚕幼虫的发育历期。GAB-3花粉对家蚕7 d的LC₅₀为261.18粒·cm^-2,随着处理时间延长,LC₅₀下降。测试的6种Bt杀虫蛋白对家蚕的毒性依次为Cry1C>Cry1Fa>Cry1B>Cry2A>Cry1Ab>Cry1Ac。目前,在中国接近商业化的转基因玉米中多采用的Bt杀虫蛋白为Cry1Ab和Cry2A,二者对家蚕的毒性较低,并且在实际生产中,家蚕接触到的转基因玉米花粉密度较低,因此转Cry抗虫基因玉米对家蚕的风险较低。     

棉花抗虫基因工程研究进展

抗虫转基因棉花的培育是近年来棉花生物技术研究的热点，它为棉杜虫害的防治展示了希望。用于棉花抗虫基因转化的方法有根癌农杆菌Ｔｉ质粒介导法、聚乙二醇法、基因枪法和花粉管通道法。用于棉花抗虫植株培育的主要基因有ＢＴ基因和ＣｐＴＩ基因，其中ＢＴ基因应用较多，用其培育出的转基因棉花，在田间用药量减少５０％的情况下而不影响产量，这些转基因棉花在美国已大面积示范推广。本文从抗虫基因的导入和抗虫基因的田间表现三个方面，综述了棉花抗虫基因工程的研究进展。并指出了该领域目前存在的主要问题和将来的发展前景。     

探讨玉米自交系农秆菌转化体系及转抗虫基因

玉米是我国重要的生产和生活作物,对国民经济影响极大,并且占有极其重要的地位.但由于玉米田受到螟虫的危害,致使玉米产量遭受重大损失,而转基因玉米植株对抗螟虫玉米品种具有很大作用,玉米外源基因转化常用基因枪法,并采用秆菌法弥补其缺点,通过分析愈伤的诱导、侵染条件、转化后的筛选、再生、移栽等建立了完整高效的农秆菌转化体系,对农业发展具有重要意义.     

转Bt基因抗虫棉对棉蚜个体生长发育和繁殖能力的影响

[目的]研究转Bt基因抗虫棉对棉蚜的个体生长发育及繁殖能力的影响.[方法]在室内研究转Bt基因棉(处理)和常规棉(对照)对棉蚜个体生长发育及繁殖能力的影响.[结果]转Bt基因抗棉铃虫棉对棉蚜发育速度、成蚜寿命、4龄若蚜体重、成蚜繁殖力无明显影响.[结论]取食转Bt基因棉花对棉蚜个体生长发育没有负面影响,转Bt基因棉花对棉蚜生长发育和繁殖是安全的.为转Bt基因抗虫棉对棉蚜的生态安全性评价提供相关依据.     

抗虫基因导入对棉花形态产量性状的影响

从棉花形态性状和产量形成特征2个方面比较系统地研究了抗虫基因导入对棉花农艺性状的影响,研究结果表明：转基因抗虫棉的单株结铃数、成铃率高于其受体品种;单株果枝数、单株果节数、铃重、衣分低于受体品种。抗虫基因导入引起的结铃性增强效应与铃重、衣分减弱效应相平衡,使得转基因抗虫棉的皮棉产量与受体品种基本持平。     

转Bt基因棉对多异瓢虫生长发育及中肠组织变化研究

[目的]研究转Bt基因棉花对多异瓢虫生长发育及中肠组织的变化.[方法]用取食转Bt-Cry 1Ab/Ac基因棉棉蚜喂饲多异瓢虫,初步研究了取食转Bt-CryAb/Ac基因棉棉蚜对多异瓢虫的影响.利用透射电镜观察取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉和取食对照花粉的多异瓢虫中肠组织的变化.用ELISA检测方法在取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉的多异瓢虫体Bt毒蛋白进行了检测.[结果]多异瓢虫Hippodamia variegata取食棉蚜后各个虫态均无显著差异;利用透射电镜观察取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉和取食对照花粉的多异瓢虫中肠组织,发现其微绒毛、线粒体、内质网均无显著变化;用ELISA检测方法在取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉的多异瓢虫体内没有检测到Bt毒蛋白.[结论]取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因棉棉蚜和花粉对多异瓢虫生长发育没有明显影响.     

生物技术在抗虫基因转育中的应用

<正> 虫害是影响农业发展的重要因素之一,全世界每年约投入200亿美元的资金用于农作物的虫害防治,但仍有5～10%的产量损失。大量施用农药不但成本高、污染环境,而且由于昆虫抗药性的增强,尽管用药量增多但虫害依然十分猖獗。近年在河北、山东、河南等地连续发现棉铃虫对现有农药已全部产生抗性,这迫使科技工作者必须采用     

转基因棉花对棉蚜个体生长发育和繁殖能力的影响

【目的】研究转基因抗虫棉及转基因高产优质棉对棉蚜个体生长发育及繁殖能力的影响。【方法】采用离体叶片上组建生命表方法,研究转基因棉对棉蚜个体生长发育及繁殖能力的影响。【结果】转基因抗虫棉和转基因高产优质棉花对棉蚜发育速度、成蚜寿命、4龄若蚜体重、成蚜繁殖力无明显影响。【结论】转基因抗虫棉和转基因高产优质棉花对棉蚜发育速度、成蚜寿命、4龄若蚜体重、成蚜繁殖力无明显影响。转基因棉花对棉蚜生长发育及繁殖力没有不利影响。     

转Bt基因棉花对土壤微生物的影响

在大田和盆栽条件下，以转Bt基因抗虫棉晋棉26号和其具有相似遗传背景的普通棉花品种晋棉7号为材料，研究棉花不同生育期的土壤细菌、真菌、放线菌及其生理菌种的变化。结果表明，转Bt基因棉晋棉对土壤微生物种类和数量有一定的影响，在某些生育期显著高于或低于普通非转基因棉花，或者差异不显著。因此，转基因安全评价需要对土壤微生物进行评价。     

Evaluation of Impact of Pollen Grains from Bt, Bt/CpTI Transgenic Cotton and Bt Corn Plants on the Growth and Development of the Mulberry Silkworm, Bombyx mori Linnaeus (Lepidoptera: Bombycidae)

The δ-endotoxin genes of Bacillus thuringiensis (Bt) and proteinase inhibitor (PI) genes aretwo kinds of genes popularly used for developing transgenic plants resistant to insect pests. To clarify whetherthere is any risk concerning the effects of pollens from these transgenic crops on non-target insects with eco-nomic importance, such as the effects on the growth and development as well as cocoon quality of the silk-worm, Bombyx mori Linnaeus, a series of feeding experiments were conducted, using pollens from transgeniccotton or corn containing crylAc, cry1A+-CpTI or crylAb genes, compared with pollens from non-transgenicnormal cotton and corn as well as the non-pollen treatment. In contrast to the latter ones, pollens from trans-genic plants showed no significant adverse effects on larval mortality, cocoon weight, pupa weight, cocoonshell weight, pupation rate, emergence rate and fecundity of the silkworm after neonates were fed with thepollens for 72 h. In addition, no dosage effects of pollens were found. Though the duration of 1st instar larvaewas prolonged in the case of feeding with transgenic pollens as compared with those of the non-pollen treat-ment, but they were not significantly different from those fed with pollens from non-transgenic cotton or corn.Meanwhile, the body weight of the 3rd instar molters fed with transgenic pollens was obviously different fromthose for non-pollen treatment, and was all significantly heavier than that of the controls. Consequently, it isconsidered that the adverse effect of pollens from transgenic insect-resistant cotton and corn on the growth anddevelopment of the silkworm is negligible.     

Bt转基因水稻米粉对家蚕生长发育及中肠亚显微结构的影响

 以 3龄家蚕为供食对象 ,用洒过转苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)基因水稻纯合品系KMD2生米粉或熟米粉的桑叶喂养 ,研究Bt抗虫水稻稻米对家蚕生长发育及中肠亚显微结构的影响 ,以明确生米粉与熟米粉之间的差异。结果发现 ,用前者喂养的家蚕体重、熟蚕数、结茧数、全茧量和茧层量均明显低于后者和对照 ,熟蚕整齐度明显迟于后者和对照 ;而后者与对照之间无明显差异。进一步的病理切片电镜分析表明 ,用前者喂养的家蚕 ,其中肠细胞亚显微结构发生了明显的变化 ,杯形细胞和圆筒形细胞的微绒毛明显变短、变粗 ,线粒体和粗面型内质网的数量显著下降 ;而后者与对照之间无显著差异。由此表明 ,经蒸煮后Bt水稻稻米中的杀虫蛋白发生变性 ,失去活性 ,进而丧失致毒能力。     

家蚕丝腺生物反应器表达狂犬病病毒核蛋白

【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统,尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系,为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列,采用家蚕丝胶蛋白基因（Ser1）启动子为特异性启动子,将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体（pBA3EGFP）中,并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个,蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中,Western blot分析表明RVNP蛋白可能附着于丝胶蛋白并随家蚕吐丝行为分泌到蚕茧中。【结论】获得了能够表达外源的RVNP蛋白的转基因家蚕品系,该系统有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。     

壬基酚对家蚕（Bombyx mori）生长发育的影响

采用添加环境激素壬基酚(Nonylphenol,NP)人工饲料饲养家蚕(Bombyx mori)的试验方法,观察了家蚕的生长速度、生长量、变态、生命力情况.结果表明,连续取食0.500mmol·L-1以上浓度壬基酚的饲料,家蚕幼虫和蛹的生长速度、生长量、发育整齐度、生命力等都明显下降,在发育后期和蜕皮、化蛹、羽化等变态时期更加明显.同时,NP在蚕体内可能有累积作用.2.000mmol·L-1浓度的NP能使家蚕幼虫很快死亡.NP对家蚕生长发育的影响有明显的性别差异,导致家蚕的雌雄大小开差缩小,并且具有显著的浓度效应和时间效应,是环境激素效应的典型表现.     

环境激素２，４－二氯苯酚对家蚕生殖发育的影响

为了探讨环境激素对鳞翅目昆虫的影响,用添加2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)的人工饲料饲养家蚕,调查2,4-DCP对家蚕生殖发育的影响.结果显示,1.60mmol·kg~(-1)以下浓度的2,4-DCP,对幼虫和蛹的卵巢生长有促进作用(P<0.05);1.60mmol·kg~(-1)的2.4-DCP对5龄后期快速生长阶段的卵巢表现出抑制作用,但在蛹期卵巢的生长获得补偿.高浓度的2,4-DCP对幼虫期、蛹期卵细胞的生长和发育有一定的促进作用(P〈0.01).2,4-DCP对家蚕雄性生殖腺的生长、特别是5龄后期精巢的快速生长期表现出一定的抑制作用,在蛹期抑制作用表现十分强烈,1.60mmol·kg~(-1)的2,4-DCP使雄蛾蚕的精巢几乎完全退化.2,4-DCP使5龄幼虫的精细胞数量微弱减少,至蛹期精细胞和蛾期精子的数量则显著少于对照(P<0.01).1.60 mmol·kg~(-1)的2,4-DCP使雌蛾的产卵数下降到对照的20%,但造卵数比对照高1.3倍,0.80 mmol·kg~(-1)以上浓度的2,4-DCP使不受精卵率显著增高(P<0.05).2,4-DCP主要通过强烈抑制家蚕雄性生殖腺和生殖细胞的发育以表现出很强的雌激素效应.     

转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟生长发育和实验种群增长的影响

以两个转Bt抗虫基因玉米品系G03-2396、G03-2739和1个常规对照品种苏玉16为材料,研究其对亚洲玉米螟幼虫生长发育和实验种群消长动态的影响.结果表明:①两个转基因玉米材料的心叶组织对玉米螟低龄幼虫的毒性很强,1龄幼虫取食这两个转基因玉米心叶组织后8 d死亡率超过97%;2龄幼虫取食心叶组织8 d后死亡率超过80%;1～4龄幼虫或全部死亡不能化蛹,或平均蛹重与对照品种相比显著降低,仅5龄幼虫各测定指标与对照品种相比差异不显著;两个转基因玉米材料的雌穗组织对玉米螟幼虫的毒性较低,即使低龄幼虫取食8 d后的死亡率与对照苏玉16相比差异也不显著.②玉米螟高龄幼虫取食两个转基因抗虫玉米心叶后,存活的部分幼虫化蛹羽化后的成虫寿命明显缩短,单雌产卵量显著下降,甚至卵的孵化率也有所降低.表明所选的两个转Bt基因玉米品系对玉米螟的毒性具一定的后续效应.     

家蚕安全转基因技术研究现状与展望

转基因技术是实现基因功能研究和生物遗传改良的重要工具。转基因生物安全问题主要包括转基因操作技术安全与转基因产品安全这两个方面。近年来业内对转基因生物的安全性研究主要集中于转基因农作物、水生动物和家禽、家畜等大型动物在医药、农业和食品工业等领域的安全评估,而对于具有重要科研与经济价值的农业昆虫安全转基因技术研究的报道则较为有限,而且农业部至今未有转基因昆虫安全性评估的先例。家蚕（Bombyx mori）是重要的鳞翅目模式昆虫和农业经济昆虫,家蚕安全转基因技术的深入研究对于促进基础遗传学发展和推动蚕丝产业发展均具有重要价值和意义。自2000年第一例转基因家蚕建立以来,转基因技术已广泛应用于家蚕基因功能鉴定的基础研究和品种改良的应用研究领域,但转基因家蚕的安全性问题却成了限制转基因家蚕实用化应用的主要瓶颈。因此,开展家蚕安全转基因技术体系研究对促进转基因家蚕安全性评估和产业化具有重要意义。本文系统地概述了基于条件基因打靶的家蚕安全转基因技术体系的建立与研究现状,讨论了家蚕安全转基因技术的发展趋势和应用前景,以期为转基因动物特别是农业转基因昆虫的安全转基因技术建立和完善提供参考。     

家蚕的变态发育过程及其激素调控

家蚕是鳞翅目昆虫的模式生物,是一种完全变态昆虫,一个生活世代要经历卵、幼虫、蛹、成虫4个显著不同的发育阶段。在变态过程中家蚕的外部形态、内部结构、生活方式及生理机能等诸多方面都要发生改变。该文综述了家蚕的变态发育过程及在变态发育中的激素调控,以期为阐述家蚕变态发育过程和调控方式以及对鳞翅目害虫的防治提供参考。     

家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析

【目的】探讨家蚕NF-kB类转录因子BmRelish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当BmNPV感染家蚕BmE细胞后BmRelish全长形式（BmRelish-FL）是否转变成其活性形式（BmRelish_act）;利用荧光定量PCR检测过表达BmRelish_act的细胞在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的BmNPV（BmNPV-EGFP）感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达BmRelish_act的细胞相比较,以确定BmRelish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达BmRelish_act的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达BmRelish_act的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】BmE细胞被BmNPV感染后,部分BmRelish-FL转变成其活性形式BmRelish_act;过表达BmRelish_act的细胞被BmNPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 kD超滤管超滤过表达BmRelish_act的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9-45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均＞3 kD,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】BmNPV感染导致BmRelish的激活;活化的BmRelish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量＜3 kD的多肽。     

家蚕组织蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鉴定、表达及其功能分析

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段,经PCR扩增,测序验证后将其连接至pET-28载体,转化至Rosseta感受态表达菌株,经IPTG在适宜温度条件下诱导,获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒,检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出,家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上,基因编号为BGIBMGA006893,nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp,编码228个氨基酸,含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测,得出该蛋白酶的分子量为26.132 k D,等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞,在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白,最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示,其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律,从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列,发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达,推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。