多重PCR方法检测猪链球菌主要致病血清型及其毒力因子

根据猪链球菌基因序列,设计合成10对引物,通过在3个反应体系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的组合优化,建立涵盖7种猪链球菌主要毒力因子mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps及猪链球菌主要致病性血清型(2、7、9型)的快速敏感的多重PCR检测方法.对不同菌株检测结果显示,该多重PCR方法特异性强、敏感性高,能快速检测出猪链球菌2、7、9型及其毒力因子表型,可用于快速诊断及猪链球菌的分子流行病学调查.     

广东部分地区猪场猪链球菌的分离与鉴定

对从广东省广州、韶关、增城、湛江、东莞、四会、河源、汕头等地规模猪场疑似猪链球菌病病猪中分离的细菌进行了鉴定,经纯化培养、菌落形态观察、革兰氏染色镜检及生化试验等传统检测方法并结合PCR检测,将20株分离菌株鉴定为猪链球菌(Streptococcus suis).     

猪链球菌鉴定及分型方法概况

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病致病菌,可导致猪患败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎及突发性死亡,也可由猪传染给人,引起人体重症链球菌感染并致死。猪链球菌的鉴定及分型方法很多,但都或多或少存在着一定的缺陷。对猪链球菌的鉴定及分型方法进行了比较,并提出了合理的分型与鉴定步骤。     

多重PCR检测猪链球菌种及主要致病血清型

根据猪链球菌种特异性基因gdh及血清2、7、9型的特异性基因cps2J、cps7H、cps9H序列,分别设计4对引物,通过对单项PCR、多重PCR扩增条件和反应体系的优化,建立了快速检测猪链球菌种及主要致病血清型2、7、9型的四重PCR方法;并利用建立的多重PCR方法对鲁西区域致病性猪链球菌的流行情况进行了调查研究。     

广西猪链球菌2型的分离及PCR鉴定

无菌操作采取疑似猪链球菌病的仔猪组织,接种血平板,对染色镜检为链球菌的菌落分纯、液体培养后进行DNA抽提,用荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白基因、胞外蛋白因子基因的特异性引物分别扩增出236bp、572bp和867bp大小的目的片段,鉴定确认该菌株为猪链球菌2型。     

猪链球菌亚种及1、2、9型四重PCR检测方法的建立

根据序列分析设计了4对引物,分别扩增猪链球菌gdh、cps1、cps2J和cps9G基因的725、212、387bp和556bp大小的片段,利用合成的4对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了四重PCR,结果显示,猪链球菌阳性出现1条725bp目的带,猪链球菌1型阳性出现725bp和212bp两条目的带,猪链球菌2型阳性出现725bp和387bp两条目的带,猪链球菌9型阳性出现725bp和556bp两条目的带。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1095株,检出猪链球菌阳性667株、猪链球菌1型8株、2型33株、9型16株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学研究。     

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869 bp和633 bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.     

猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。【结论】成功建立的SS9 FQ-PCR诊断方法,可用于临床SS9型病菌感染的快速诊断及样品中细菌含量的定量分析。     

荧光定量PCR检测猪链球菌2型主要毒力因子方法的建立

[目的]建立荧光定量PCR检测猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)和胞外因子(Extracellular protein factor,EF)3种主要毒力因子的方法。[方法]根据cps2j、mrp和ef基因的基因序列,分别设计并合成3对引物及相应的Taqman探针,其中cps2j和mrp的5'端标记FAM荧光发射基团,ef的5'端标记HEX荧光发射基团,3种基因的3'端都标记BHQ1淬灭荧光基团。通过优化反应体系和程序,建立了一种基于Taqman探针法的荧光定量PCR方法检测上述3种主要毒力因子,其中cps2j单独检测,mrp与ef的实行双重荧光PCR方法检测。[结果]cps2j、mrp和ef的最低检测限分别为12、51和51 CFU,灵敏度很高;与其他病原菌无交叉反应,重复性及特异性均较好;此外,整个检测过程在60 min内即可完成。[结论]该试验所建立的双重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测猪链球菌2型3种主要毒力因子。     

多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株

为了鉴定猪链球菌2型毒力菌株,根据猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖基因(capsular polysaccharide 2J,cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(muramidase-released protein,mrp)、毒力相关序列orf2基因(virulent-associate sequence orf2)设计合成3对引物,建立三重PCR检测方法,并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示:26株SS2致病菌株均同时扩增出这3个目的片段,5株其他血清型猪链球菌(SS1,SS7,SS9)及13株非猪链球菌的其他猪源链球菌(兰氏B群、C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp片段,检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的扩增片段经HincⅡ酶切鉴定,与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2J,mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较,同源性分别为99%、100%、94%。该PCR敏感极限是600个细菌/每个反应。本试验所建立的三重PCR,特异性强,敏感性好,可用于实验室的快速诊断。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

吉林地区猪链球菌的分离及快速检测方法的建立

从吉林市周边地区8个猪场收集病料,采集疑似猪链球菌的猪样品,进行病原菌的分离、生化试验、动物致病性试验和毒力因子的PCR检测。共分离到8株分离株,其中3株有致病性,5株无致病性。PCR能够高效、快速诊断出该病菌是否有致病性。该试验结果可为正确及时诊断治疗链球菌病提供理论依据。     

荧光定量PCR检测猪肝中猪链球菌2型的基因组DNA提取方法的比较

[目的]在人工布菌猪肝中评估溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法提取猪链球菌2型基因组DNA在荧光定量检测中的应用效果,为猪链球菌2型的荧光定量检测选择合理的基因组DNA提取方法提供试验依据。[方法]采用溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法分别提取人工布菌猪肝样本中猪链球菌2型基因组DNA,通过荧光定量PCR技术检测猪链球菌2型的相对含量。[结果]利用荧光定量方法能够检测到猪链球菌2型。该方法可以最低检测到12 CFU/g的猪链球菌,特异性良好,标准曲线方程为y=-3.185 9x+39.901 0。在人工布菌猪肝样本中,溶菌酶-苯酚法在q PCR实验中检测猪链球菌2型较灵敏。[结论]溶菌酶-苯酚法在猪肝样品中提取基因组DNA效果较好;试剂盒法在细菌纯培养物中提取基因组DNA具有安全、高效等优点。     

猪链球菌分子生物学检测研究进展

猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原.目前,PCR是检测猪链球菌最常用的方法.可以通过扩增猪链球菌特有的基因片段(cps、gdh)等鉴定出猪种链球菌,然而很多新分离的菌株还无法用PCR方法进行鉴定.新的分子生物学检测方法在基因的水平上.对猪链球菌新分离菌株进行定型和阐述猪链球菌毒力株与无毒力株之间的差别的运用发展越来越快.     

用斑马鱼检测猪链球菌2型的致病力

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）菌株致病力各异，以斑马鱼为实验动物，建立了较为简便可靠的SS2致病力检测方法。【方法】选用1 005尾AB系斑马鱼（Danio rerio）以检测SS2不同分离株的致病力。检测8株基因型均为mrp+ef+、对猪有致病力的SS2菌株。【结果】结果斑马鱼接种菌株12 h后呈败血症病变，96 h内对斑马鱼的半数致死量（LD50）在5.36×103至5.01×104 cfu之间。上述接种菌株的斑马鱼均从体内重新分离到接种菌。同时检测1株基因型为mrp-ef-、对猪无致病力的SS2菌株，斑马鱼接种后96 h内不表现任何病变，亦不出现死亡，对斑马鱼的LD50>106 cfu。SS2有毒力株和无毒力株对斑马鱼的LD50差异极显著（P＜0.01）。【结论】斑马鱼可作为研究猪链球菌2型菌株感染的动物模型。     

猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探

目的:克隆、表达猪链球菌2型菌株ZY05719的膜蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶基因(hm6),分析其重组蛋白的生物学活性。方法:基于GenBank中S.suis P1/7SSU1634蛋白的基因序列设计引物,克隆ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因并进行序列分析;构建pET28a-hm6原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,重组HM6蛋白即二氢硫辛酰胺脱氢酶用His亲和层析镍柱纯化后,通过SDS蛋白电泳鉴定分析并利用新西兰大白兔制备抗血清,研究其酶活性及其在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中的作用。结果:克隆了1 761bp的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,纯化的70kD重组融合蛋白具有良好的酶活性和免疫原性,且在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中具有作用。结论:成功克隆、表达了ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,初步揭示了其生物学活性,为深入研究二氢硫辛酰胺脱氢酶在猪链球菌致病机制中的作用奠定了基础。